Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter mellores resultados, recomendámosche que uses unha versión máis recente do teu navegador (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
O crecemento microbiano nas feridas maniféstase a miúdo como biopelículas, que interfiren coa cicatrización e son difíciles de erradicar. Os novos apósitos de prata afirman combater as infeccións de feridas, pero a súa eficacia antibiopelícula e os seus efectos de cicatrización independentes da infección son xeralmente descoñecidos. Usando modelos de biopelícula in vitro e in vivo de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, informamos da eficacia dos apósitos xeradores de ións Ag1+; apósitos Ag1+ que conteñen ácido etilendiaminotetraacético e cloruro de benzetonio (Ag1+/EDTA/BC) e apósitos que conteñen nitrato de prata (oxisales de Ag), que producen ións Ag1+, Ag2+ e Ag3+ para combater a biopelícula de feridas e o seu efecto na cicatrización. Os apósitos Ag1+ tiveron efectos mínimos sobre a biopelícula de feridas in vitro e en ratos (C57BL/6j). Pola contra, as sales de Ag osixenadas e os apósitos Ag1+/EDTA/BC reduciron significativamente o número de bacterias viables en biopelículas in vitro e demostraron unha redución significativa nos compoñentes bacterianos e EPS en biopelículas de feridas de ratos. Estes apósitos tiveron diferentes efectos na cicatrización das feridas infectadas con biopelícula e non infectadas con biopelícula, e os apósitos de sales osixenadas tiveron efectos máis beneficiosos sobre a reepitelización, o tamaño da ferida e a inflamación en comparación cos tratamentos de control e outros apósitos de prata. As diferentes propiedades fisicoquímicas dos apósitos de prata poden ter diferentes efectos sobre o biopelícula da ferida e a cicatrización, e isto debe terse en conta ao seleccionar un apósito para o tratamento de feridas infectadas con biopelícula.
As feridas crónicas defínense como «feridas que non progresan a través das etapas normais de curación de maneira ordenada e oportuna»1. As feridas crónicas crean unha carga psicolóxica, social e económica para os pacientes e o sistema sanitario. O gasto anual do NHS no tratamento de feridas e comorbilidades asociadas estímase en 8.300 millóns de libras en 2017-182. As feridas crónicas tamén son actualmente un problema urxente nos Estados Unidos, e Medicare estima o custo anual do tratamento de pacientes con feridas entre 28.100 e 96.800 millóns de dólares3.
A infección é un factor importante que impide a cicatrización das feridas. As infeccións adoitan manifestarse como biopelículas, que están presentes no 78 % das feridas crónicas que non cicatrizan. As biopelículas fórmanse cando os microorganismos se adhiren irreversiblemente a superficies, como as superficies das feridas, e poden agregarse para formar comunidades produtoras de polímeros extracelulares (EPS). A biopelícula das feridas está asociada a un aumento da resposta inflamatoria que leva a danos nos tecidos, o que pode atrasar ou impedir a cicatrización4. O aumento do dano nos tecidos pode deberse en parte ao aumento da actividade das metaloproteinases da matriz, a colagenase, a elastase e as especies reactivas de osíxeno5. Ademais, as células inflamatorias e as biopelículas son en si mesmas grandes consumidoras de osíxeno e, polo tanto, poden causar hipoxia tisular local, o que esgota as células do osíxeno vital necesario para unha reparación eficaz dos tecidos6.
Os biofilmes maduros son moi resistentes aos axentes antimicrobianos, o que require estratexias agresivas para controlar as infeccións por biofilmes, como o tratamento mecánico seguido dun tratamento antimicrobiano eficaz. Dado que os biofilmes poden rexenerarse rapidamente, os antimicrobianos eficaces poden reducir o risco de reformación despois do desbridamento cirúrxico7.
A prata úsase cada vez máis en apósitos antimicrobianos e adoita empregarse como tratamento de primeira liña para feridas infectadas crónicas. Existen moitos apósitos de prata dispoñibles comercialmente, cada un contén unha composición, concentración e matriz base de prata diferente. Os avances nos brazaletes de prata levaron ao desenvolvemento de novos brazaletes de prata. A forma metálica da prata (Ag0) é inerte; para lograr a eficacia antimicrobiana, debe perder un electrón para formar prata iónica (Ag1+). Os apósitos de prata tradicionais conteñen compostos de prata ou prata metálica que, cando se expoñen ao líquido, descompoñense para formar ións Ag1+. Estes ións Ag1+ reaccionan coa célula bacteriana, eliminando electróns dos compoñentes estruturais ou procesos críticos necesarios para a supervivencia. A tecnoloxía patentada levou ao desenvolvemento dun novo composto de prata, os oxisales de Ag (nitrato de prata, Ag7NO11), que se inclúe nos apósitos para feridas. A diferenza da prata tradicional, a descomposición dos sales que conteñen osíxeno produce estados de prata con maior valencia (Ag1+, Ag2+ e Ag3+). Os estudos in vitro demostraron que as baixas concentracións de sales de prata osixenadas son máis eficaces que a prata dun só ión (Ag1+) contra bacterias patóxenas como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli8,9. Outro novo tipo de apósito de prata inclúe ingredientes adicionais, concretamente ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e cloruro de bencetonio (BC), que se informou que actúan sobre o biofilm EPS e, polo tanto, aumentan a penetración da prata no biofilm. Estas novas tecnoloxías da prata ofrecen novas formas de atacar os biofilms das feridas. Non obstante, o impacto destes antimicrobianos no ambiente da ferida e na cicatrización independente da infección é importante para garantir que non creen un ambiente desfavorable da ferida nin atrasen a cicatrización. Informouse de preocupacións sobre a citotoxicidade da prata in vitro con varios apósitos de prata10,11. Non obstante, a citotoxicidade in vitro aínda non se traduciu en toxicidade in vivo, e varios apósitos Ag1+ demostraron un bo perfil de seguridade12.
Aquí, investigamos a eficacia dos apósitos de carboximetilcelulosa que conteñen novas formulacións de prata contra o biofilm de feridas in vitro e in vivo. Ademais, avaliáronse os efectos destes apósitos nas respostas inmunitarias e na cicatrización independentemente da infección.
Todos os apósitos empregados estaban dispoñibles comercialmente. O apósito de fibra de xel 3M Kerracel (3M, Knutsford, Reino Unido) é un apósito de fibra de xel 100 % de carboximetilcelulosa (CMC) non antimicrobiano que se empregou como apósito de control neste estudo. Avaliáronse tres apósitos de prata CMC antimicrobianos, concretamente o apósito 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Reino Unido), que contén un 1,7 % en peso de sal de prata osixenada (Ag7NO11) en ións de prata de maior valencia (Ag1+, Ag2+ e Ag3+). Durante a descomposición de Ag7NO11, fórmanse ións Ag1+, Ag2+ e Ag3+ nunha proporción de 1:2:4. Apósito Aquacel Ag Extra que contén 1,2 % de cloruro de prata (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Reino Unido) 13 e apósito Aquacel Ag + Extra que contén 1,2 % de cloruro de prata (Ag1+), EDTA e cloruro de bencetonio (ConvaTec, Deeside, Reino Unido) 14.
As cepas empregadas neste estudo foron Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) e Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
As bacterias cultiváronse durante a noite en caldo Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Reino Unido). O cultivo durante a noite diluíuse entón 1:100 en caldo Mueller-Hinton e sementouse con 200 µl en membranas estériles de cicloporo Whatman de 0,2 µm (Whatman plc, Maidstone, Reino Unido) en placas de ágar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Gran Bretaña).) Formación de biopelículas coloniais a 37 °C durante 24 horas. Estas biopelículas coloniais foron analizadas para determinar a súa contracción logarítmica.
Cortar o apósito en anacos cadrados de 3 cm2 e humedecer previamente con auga desionizada estéril. Colocar a venda sobre o biofilm da colonia na placa de ágar. Elimináronse cada 24 ha de biofilm e cuantificáronse as bacterias viables dentro do biofilm (UFC/ml) mediante dilución seriada (10−1 a 10−7) en caldo de neutralización de ángulo de día (Merck-Millipore). Despois de 24 horas de incubación a 37 °C, realizáronse contaxes estándar en placas de ágar Mueller-Hinton. Cada tratamento e punto temporal realizouse por triplicado e repetiuse a contaxe en placas para cada dilución.
A pel de barriga de porco obtense de porcas femias de raza Large White nos 15 minutos posteriores ao sacrificio, de acordo coas normas de exportación da Unión Europea. A pel rapouse e limpouse con toalliñas con alcol e, a continuación, conxelouse a -80 °C durante 24 horas para desvitalizala. Despois da desconxelación, laváronse anacos de pel de 1 cm2 tres veces con PBS, hipoclorito de sodio ao 0,6 % e etanol ao 70 % durante 20 minutos cada vez. Antes de retirar a epiderme, eliminouse calquera resto de etanol lavando 3 veces en PBS estéril. A pel cultivouse nunha placa de 6 pozos cunha membrana de nailon de 0,45 μm de grosor (Merck-Millipore) na parte superior e 3 compresas absorbentes (Merck-Millipore) que contiñan 3 ml de soro fetal bovino (Sigma) suplementado cun 10 % de medio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Os biofilmes coloniais cultiváronse como se describe para os estudos de exposición a biofilmes. Despois de cultivar o biofilme na membrana durante 72 horas, aplicouse o biofilme á superficie da pel usando un asa de inoculación estéril e retirouse a membrana. Despois, o biofilme incubouse na derme do porco durante 24 horas adicionais a 37 °C para permitir que o biofilme madurase e se adherise á pel do porco. Despois de que o biofilme madurase e se adherise, aplicouse un apósito de 1,5 cm2, previamente humedecido con auga destilada estéril, directamente á superficie da pel e incubouse a 37 °C durante 24 horas. As bacterias viables visualizáronse mediante tinguidura aplicando uniformemente o reactivo de viabilidade celular PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) á superficie apical de cada explante e incubándoo durante 5 minutos. Use a cámara dixital Leica DFC425 para capturar imaxes instantaneamente no microscopio Leica MZ8. As áreas coloreadas de rosa cuantificáronse usando o software Image Pro versión 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). A microscopía electrónica de varrido realizouse como se describe a continuación.
As bacterias cultivadas durante a noite diluíronse 1:100 en caldo Mueller-Hinton. Engadíronse 200 μl de cultivo a unha membrana estéril de cicloporo Whatman de 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Reino Unido) e cultiváronse en ágar Mueller-Hinton. As placas de biofilm incubáronse a 37 °C durante 72 horas para permitir a formación de biofilm maduro.
Despois de 3 días de maduración do biofilme, colocouse unha venda cadrada de 3 cm2 directamente sobre o biofilme e incubouse a 37 °C durante 24 horas. Despois de retirar a venda da superficie do biofilme, engadiuse 1 ml de reactivo de viabilidade celular PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) á superficie de cada biofilme durante 20 segundos. As superficies secáronse antes de rexistrar os cambios de cor cunha cámara dixital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Reino Unido).
Preparar cultivos durante a noite en ágar Mueller-Hinton, transferir as colonias individuais a 10 ml de caldo Mueller-Hinton e incubar nun axitador a 37 °C (100 rpm). Despois da incubación durante a noite, o cultivo diluíuse 1:100 en caldo Mueller-Hinton e colocáronse 300 µl nunha membrana circular de cicloporo Whatman de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Reino Unido) en ágar Mueller-Hinton e incubarse a 37 °C en 72 horas. O biofilme maduro aplicouse á ferida como se describe a continuación.
Todo o traballo con animais levouse a cabo na Universidade de Manchester baixo unha licenza de proxecto aprobada pola Oficina de Benestar Animal e Revisión Ética (P8721BD27) e de acordo coas directrices publicadas polo Ministerio do Interior baixo a ASPA revisada de 2012. Todos os autores cumpriron as directrices de chegada. Para todos os estudos in vivo utilizáronse ratos C57BL/6j de oito semanas de idade (Envigo, Oxon, Reino Unido). Os ratos foron anestesiados con isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Reino Unido) e as súas superficies dorsais foron afeitadas e limpadas. A cada rato fíxoselle despois unha ferida escisional de 2 × 6 mm usando un punzón de biopsia Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Reino Unido). Para feridas infectadas con biopelícula, aplique biopelícula colonial de 72 horas cultivada na membrana como se describiu anteriormente á capa dérmica da ferida usando un asa de inoculación estéril inmediatamente despois da lesión e descarte a membrana. Humedécase previamente un centímetro cadrado de apósito con auga estéril para manter un ambiente húmido na ferida. Aplicáronse apósitos directamente a cada ferida e cubríronse cunha película de 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Reino Unido) e adhesivo líquido Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicado arredor dos bordos para proporcionar unha adhesión adicional. Administrouse buprenorfina (Animalcare, York, Reino Unido) a unha concentración de 0,1 mg/kg como analxésico. Sacrificáronse os ratos tres días despois da lesión utilizando o método da Lista 1 e retiráronse, dividíronse pola metade e almacénanse a zona da ferida segundo fose necesario.
A tinción con hematoxilina (ThermoFisher Scientific) e eosina (ThermoFisher Scientific) realizouse segundo o protocolo do fabricante. A área da ferida e a reepitelización cuantificáronse usando o software Image Pro versión 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
As seccións de tecido foron desparafinadas en xileno (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), rehidratadas con etanol graduado ao 100–50 % e mergulladas brevemente en auga desionizada (ThermoFisher Scientific). A inmunohistoquímica realizouse usando o kit VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, California) segundo o protocolo do fabricante. Os anticorpos primarios contra os neutrófilos NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) e os macrófagos Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) diluíronse 1:100 en solución de bloqueo e engadíronse á superficie cortada, seguidos de 2 anticorpos anti-, VectaStain ABC e o kit de substrato Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, California) e contratuníronse con hematoxilina. As imaxes foron adquiridas empregando un microscopio Olympus BX43 e unha cámara dixital Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Reino Unido).
As mostras de pel fixáronse en glutaraldehído ao 2,5 % e formaldehído ao 4 % en HEPES 0,1 M (pH 7,4) durante 24 horas a 4 °C. As mostras deshidratáronse con etanol graduado e secáronse en CO2 cun secador de puntos críticos Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Reino Unido) e revestíronse por pulverización catódica cunha aliaxe de ouro-paladio cun sistema de mini pulverización catódica/descarga luminescente Quorum SC7620. As mostras obtivéronse imaxes cun microscopio electrónico de varrido FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) para visualizar o punto central da ferida.
Aplicouse ioduro de Toto-1 (2 μM) á superficie da ferida excisada do rato e incubouse durante 5 minutos a 37 °C (ThermoFisher Scientific) e tratouse con Syto-60 (10 μM) a 37 °C (ThermoFisher Scientific). As imaxes Z-stack de 15 minutos creáronse cun Leica TCS SP8.
Os datos biolóxicos e técnicos de réplica foron tabulados e analizados mediante o software Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Utilizouse unha análise unidireccional da varianza con comparacións múltiples mediante a proba post hoc de Dunnett para comprobar as diferenzas entre cada tratamento e o apósito de control non antimicrobiano. Un valor p <0,05 considerouse significativo.
A eficacia dos apósitos fibrosos de xel de prata avaliouse primeiro contra colonias de biopelículas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa in vitro. Os apósitos de prata conteñen diferentes fórmulas de prata: os apósitos de prata tradicionais producen ións Ag1+; os apósitos de prata, que poden producir ións Ag1+ despois da adición de EDTA/BC, poden destruír a matriz do biopelícula e expoñer as bacterias á prata baixo o efecto antibacteriano da prata. ións15 e apósitos que conteñen sales de Ag osixenadas que producen ións Ag1+, Ag2+ e Ag3+. A súa eficacia comparouse cun apósito de control non antimicrobiano feito con fibras xelificadas. As bacterias viables restantes dentro da biopelícula avaliáronse cada 24 horas durante 8 días (Figura 1). No día 5, a biopelícula foi reinoculada con 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus ou 1,22×105P. aeruginosa para avaliar a recuperación da biopelícula. En comparación cos apósitos de control non antimicrobianos, os apósitos Ag1+ tiveron un efecto mínimo sobre a viabilidade bacteriana en biopelículas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa durante 5 días. Pola contra, os apósitos que contiñan Ag osixenado e sales de Ag1+ + EDTA/BC foron eficaces para matar as bacterias dentro da biopelícula en 5 días. Tras a inoculación repetida con bacterias planctónicas no día 5, non se observou ningunha restauración da biopelícula (Fig. 1).
Cuantificación de bacterias viables en biopelículas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa despois do tratamento con apósitos de prata. As colonias de biopelículas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa tratáronse con apósitos de prata ou apósitos de control non antimicrobianos, e o número de bacterias viables restantes determinouse cada 24 horas. Despois de 5 días, a biopelícula foi reinoculada con 3,85×105S. Staphylococcus aureus ou 1,22×105P. As colonias do bacterioplancto Pseudomonas aeruginosa formáronse individualmente para avaliar a recuperación da biopelícula. Os gráficos mostran a media +/- do erro estándar.
Para visualizar o efecto dos apósitos de prata na viabilidade do biofilm, aplicáronse apósitos a biofilms maduros cultivados en pel porcina ex vivo. Despois de 24 horas, o apósito elimínase e o biofilm tínguese cun colorante reactivo azul, que é metabolizado por bacterias vivas a unha cor rosa. Os biofilms tratados con apósitos de control eran rosas, o que indica a presenza de bacterias viables dentro do biofilm (Figura 2A). En contraste, o biofilm tratado co apósito de oxisols de Ag era principalmente azul, o que indica que as bacterias restantes na superficie da pel do porco eran bacterias non viables (Figura 2B). Observouse unha coloración mesturada de azul e rosa nos biofilms tratados con apósitos que conteñen Ag1+, o que indica a presenza de bacterias viables e non viables dentro do biofilm (Figura 2C), mentres que os apósitos con EDTA/BC que conteñen Ag1+ eran predominantemente azuis con algunhas manchas rosas, o que indica áreas non afectadas polo apósito de prata (Figura 2D). A cuantificación das áreas activas (rosa) e inactivas (azul) mostrou que o parche de control tiña un 75 % de actividade (Figura 2E). Os apósitos Ag1+ + EDTA/BC tiveron un rendemento similar aos apósitos con sales de Ag osixenadas, con taxas de supervivencia do 13 % e o 14 %, respectivamente. O apósito Ag1+ tamén reduciu a viabilidade bacteriana nun 21 %. Estes biofilmes observáronse mediante microscopía electrónica de varrido (SEM). Despois do tratamento co apósito de control e o apósito Ag1+, observouse unha capa de Pseudomonas aeruginosa que cubría a pel porcina (Figura 2F,H), mentres que despois do tratamento co apósito Ag1+ atopáronse poucas células bacterianas e poucas células bacterianas debaixo. As fibras de coláxeno poden considerarse como a estrutura tisular da pel porcina (Figura 2G). Despois do tratamento co apósito Ag1+ + EDTA/BC, eran visibles placas bacterianas e placas de fibras de coláxeno subxacentes (Figura 2I).
Visualización do biofilme de Pseudomonas aeruginosa despois do tratamento con apósitos de prata. (A–D) A viabilidade bacteriana en biofilmes de Pseudomonas aeruginosa cultivados en pel porcina visualizouse usando o colorante de viabilidade PrestoBlue 24 horas despois do tratamento con apósitos de prata ou apósitos de control non antimicrobianos. As bacterias vivas son rosas, as bacterias non viables e a pel de porco son azuis. (E) Cuantificación de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa cultivados en pel porcina (mancha rosa) usando microscopía electrónica de varrido Image Pro versión 10 (FI) e tratados cun apósito de prata ou un apósito de control non antimicrobiano durante 24 horas. Barra de escala SEM = 5 µm. (J–M) Os biofilmes coloniais creceron en filtros e foron tinguidos con colorante reactivo PrestoBlue despois de 24 h de incubación con apósitos de prata.
Para determinar se o contacto próximo entre os apósitos e os biofilmes afectaba á eficacia dos apósitos, tratáronse biofilmes coloniais colocados sobre unha superficie plana cos apósitos durante 24 horas e despois tinguíronse con colorantes reactivos. O biofilme non tratado era de cor rosa escura (Figura 2J). En contraste cos biofilmes tratados con apósitos que contiñan sales de Ag osixenadas (Figura 2K), os biofilmes tratados con apósitos que contiñan Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC mostraron bandas de tinción rosa (Figura 2L,M). Esta coloración rosa indica a presenza de bacterias viables e está asociada coa área de sutura dentro do apósito. Estas áreas cosidas crean espazos mortos que permiten que as bacterias dentro do biofilme sobrevivan.
Para avaliar a eficacia dos apósitos de prata in vivo, tratáronse feridas extirpadas de grosor total de ratos infectados con biopelículas maduras de S. aureus e P. aeruginosa con apósitos de control non antimicrobianos ou apósitos de prata. Despois de 3 días de tratamento, a análise macroscópica de imaxes mostrou tamaños de feridas máis pequenos cando se trataron con apósitos de sales osixenadas en comparación cos apósitos de control non antimicrobianos e outros apósitos de prata (Figura 3A-H). Para confirmar estas observacións, recolléronse feridas e cuantificáronse a área da ferida e a reepitelización en seccións de tecido tinguidas con hematoxilina e eosina usando o software Image Pro versión 10 (Figura 3I-L).
O efecto dos apósitos de prata na superficie da ferida e a reepitelización de feridas infectadas con biofilmes. (A–H) Células pequenas infectadas con biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (A–D) e Staphylococcus aureus (E–H) despois de tres días de tratamento cun apósito de control non antimicrobiano, un apósito de sal de Ag osixenado, un apósito Ag1+ e un apósito Ag1+. Imaxes macroscópicas representativas. Feridas de ratos con apósito Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infección representativa por Pseudomonas aeruginosa, seccións histolóxicas tinguidas con hematoxilina e eosina, utilizadas para cuantificar a área da ferida e a rexeneración epitelial. Cuantificación da área da ferida (M, O) e porcentaxe de reepitelización (N, P) de feridas infectadas con biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (M, N) e Staphylococcus aureus (O, P) (por grupo de tratamento n = 12). Os gráficos mostran a media +/- do erro estándar. * significa p = < 0,05 ** significa p = < 0,01; escala macroscópica = 2,5 mm, escala histolóxica = 500 µm.
A cuantificación da área da ferida en feridas infectadas con biopelícula de Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) mostrou que as feridas tratadas con oxisales de Ag tiñan un tamaño medio da ferida de 2,5 mm2, mentres que o apósito de control non antimicrobiano tiña un tamaño medio da ferida de 3,1 mm2, o que non é certo. alcanzou significación estatística (Figura 3M). p = 0,423). As feridas tratadas con Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC non mostraron unha redución na área da ferida (3,1 mm2 e 3,6 mm2, respectivamente). O tratamento con apósito de sales de Ag osixenadas promoveu a reepitelización en maior medida que o apósito de control non antimicrobiano (34 % e 15 %, respectivamente; p = 0,029) e Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC (10 % e 11 %) (Figura 3N). . , respectivamente).
Observáronse tendencias semellantes na área da ferida e na rexeneración epitelial en feridas infectadas con biopelículas de S. aureus (Figura 3O). Os apósitos que contiñan sales de prata osixenadas reduciron a área da ferida (2,0 mm2) nun 23 % en comparación co apósito non antimicrobiano de control (2,6 mm2), aínda que esta redución non foi significativa (p = 0,304) (Fig. 3O). Ademais, a área da ferida no grupo de tratamento con Ag1+ reduciuse lixeiramente (2,4 mm2), mentres que a ferida tratada con apósito Ag1+ + EDTA/BC non reduciu a área da ferida (2,9 mm2). Os sales de osíxeno de Ag tamén promoveron a reepitelización das feridas infectadas con biopelícula de S. aureus (31 %) en maior medida que as tratadas con apósitos de control non antimicrobianos (12 %, p = 0,003) (Figura 3P). O apósito Ag1+ (16 %, p = 0,903) e o apósito Ag+1 + EDTA/BC (14 %, p = 0,965) mostraron niveis de rexeneración epitelial similares aos do grupo de control.
Para visualizar o efecto dos apósitos de prata na matriz do biofilme, realizouse tinguidura con ioduro de Toto 1 e Syto 60 (Fig. 4). O ioduro de Toto 1 é un colorante impermeable ás células que se pode usar para visualizar con precisión os ácidos nucleicos extracelulares, que son abundantes nos EPS dos biofilmes. O Syto 60 é un colorante permeable ás células que se usa como contratinción16. As observacións do ioduro de Toto 1 e Syto 60 en feridas inoculadas con biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) e Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) mostraron que despois de 3 días de tratamento con apósitos, o EPS no biofilme reduciuse significativamente. Os apósitos Ag1+ sen compoñentes antibiopelícula adicionais reduciron significativamente o ADN libre de células en feridas inoculadas con Pseudomonas aeruginosa, pero foron menos eficaces en feridas inoculadas con Staphylococcus aureus.
Imaxes in vivo de biofilmes de feridas despois de 3 días de tratamento con apósitos de control ou de prata. Imaxes confocais de Pseudomonas aeruginosa (A-D) e Staphylococcus aureus (I-L) tinguidas con Toto 1 (verde) para visualizar ácidos nucleicos extracelulares, un compoñente dos polímeros de biofilmes extracelulares. Para tinguir ácidos nucleicos intracelulares, use Syto 60 (vermello). ácidos. P. Microscopía electrónica de varrido de feridas infectadas con biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (E-H) e Staphylococcus aureus (M-P) despois de 3 días de tratamento con apósitos de control e de prata. Barra de escala SEM = 5 µm. Barra de escala de imaxe confocal = 50 µm.
A microscopía electrónica de varrido mostrou que os ratos inoculados con colonias de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) e Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) tiñan significativamente menos bacterias nas súas feridas despois de 3 días de tratamento con apósitos de prata.
Para avaliar o efecto dos apósitos de prata sobre a inflamación das feridas en ratos infectados con biopelícula, tinguíronse inmunohistoquimicamente seccións de feridas infectadas con biopelícula tratadas con apósitos de control ou de prata durante 3 días utilizando anticorpos específicos para neutrófilos e macrófagos. Determinación cuantitativa de neutrófilos e macrófagos internamente. tecido de granulación. Figura 5). Todos os apósitos de prata reduciron o número de neutrófilos e macrófagos nas feridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa en comparación cos apósitos de control non antimicrobianos despois de tres días de tratamento. Non obstante, o tratamento co apósito de sal de prata osixenado resultou nunha maior redución de neutrófilos (p = <0,0001) e macrófagos (p = <0,0001) en comparación con outros apósitos de prata probados (Figura 5I,J). Aínda que Ag1+ + EDTA/BC tivo un maior efecto sobre a biopelícula da ferida, reduciu os niveis de neutrófilos e macrófagos en menor medida que o apósito Ag1+. Tamén se observaron feridas moderadas infectadas con biopelícula de S. aureus despois de curar con oxisois de Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) e Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) en comparación co control. Obsérvanse tendencias similares para a neutropenia. vendaxe (Fig. 5K). Non obstante, só o apósito con sales de Ag osixenadas mostrou unha redución significativa no número de macrófagos no tecido de granulación en comparación co control en feridas infectadas con biopelículas de S. aureus (p = 0,0339) (Figura 5L).
Os neutrófilos e macrófagos foron cuantificados en feridas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus despois de 3 días de tratamento con control non antimicrobiano ou apósitos de prata. Os neutrófilos (AD) e os macrófagos (EH) foron cuantificados en seccións de tecido tinguidas con anticorpos específicos para neutrófilos ou macrófagos. Cuantificación de neutrófilos (I e K) e macrófagos (J e L) en feridas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (I e J) e Staphylococcus aureus (K e L). N = 12 por grupo. Os gráficos mostran a media +/- erro estándar, valores de significancia en comparación co apósito de control non antibacteriano, * significa p = < 0,05, ** significa p = < 0,01; *** significa p = < 0,001; indica p = < 0,0001).
Despois avaliamos o efecto dos apósitos de prata na cicatrización independente da infección. As feridas excisionais non infectadas tratáronse cun apósito de control non antimicrobiano ou cun apósito de prata durante 3 días (Figura 6). Entre os apósitos de prata probados, só as feridas tratadas co apósito de sal osixenado apareceron máis pequenas nas imaxes macroscópicas que as feridas tratadas co control (Figura 6A-D). A cuantificación da área da ferida mediante análise histolóxica mostrou que a área media da ferida despois do tratamento co apósito de oxisol de Ag foi de 2,35 mm2 en comparación con 2,96 mm2 para as feridas tratadas co grupo de control, pero esta diferenza non alcanzou a significación estatística (p = 0,488) (Fig. 6I). Pola contra, non se observou ningunha redución na área da ferida despois do tratamento con apósitos Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ou Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) en comparación co grupo de control. Observouse un aumento da rexeneración epitelial co apósito de oxisol de Ag en comparación co grupo de control (30 % fronte a 22 %, respectivamente), aínda que isto non alcanzou a significación (p = 0,067), isto é bastante significativo e confirma resultados previos. Un apósito con oxisoles promove a reepitelización. -Epitelización de feridas non infectadas17. En contraste, o tratamento con apósitos Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC non tivo efecto ou mostrou unha diminución da reepitelización en comparación co control.
Efecto do apósito de prata para feridas na cicatrización de feridas en ratos non infectados con resección completa. (AD) Imaxes macroscópicas representativas de feridas despois de tres días de tratamento cun apósito de control non antimicrobiano e un apósito de prata. (EH) Seccións de feridas representativas tinguidas con hematoxilina e eosina. A cuantificación da área da ferida (I) e a porcentaxe de reepitelización (J) calculáronse a partir de seccións histolóxicas no punto medio da ferida mediante software de análise de imaxes (n = 11–12 por grupo de tratamento). Os gráficos mostran a media +/- erro estándar. * medias p = <0,05.
A prata ten unha longa historia de uso como terapia antimicrobiana na cicatrización de feridas, pero as moitas formulacións e métodos de administración diferentes poden dar lugar a diferenzas na eficacia antimicrobiana 18. Ademais, as propiedades antibiopelícula de sistemas específicos de administración de prata non se comprenden completamente. Aínda que a resposta inmunitaria do hóspede é relativamente eficaz contra as bacterias planctónicas, xeralmente é menos eficaz contra os biopelículas 19. As bacterias planctónicas son fagocitadas facilmente polos macrófagos, pero dentro dos biopelículas, as células agregadas supoñen problemas adicionais ao limitar a resposta do hóspede ata o punto de que as células inmunitarias poden sufrir apoptose e liberar factores proinflamatorios para mellorar a resposta inmunitaria 20. Observouse que algúns leucocitos poden penetrar nos biopelículas 21 pero non son capaces de fagocitar as bacterias unha vez que esta defensa está comprometida 22. Deberíase usar unha abordaxe holística para apoiar a resposta inmunitaria do hóspede contra a infección do biopelícula da ferida. O desbridamento de feridas pode interromper fisicamente o biopelícula e eliminar a maior parte da biocarga, pero a resposta inmunitaria do hóspede pode ser ineficaz contra o biopelícula restante, especialmente se a resposta inmunitaria do hóspede está comprometida. Polo tanto, as terapias antimicrobianas como os apósitos de prata poden reforzar a resposta inmunitaria do hóspede e eliminar as infeccións por biopelículas. A composición, a concentración, a solubilidade e o substrato de administración poden influír na eficacia antimicrobiana da prata. Nos últimos anos, os avances na tecnoloxía de procesamento da prata fixeron que estes apósitos sexan máis eficaces9,23. A medida que avanza a tecnoloxía dos apósitos de prata, é importante comprender a eficacia destes apósitos para controlar a infección das feridas e, o que é máis importante, o impacto destas potentes formas de prata no ambiente da ferida e na cicatrización.
Neste estudo, comparamos a eficacia de dous apósitos de prata avanzados con apósitos de prata convencionais que producen ións Ag1+ contra biopelículas utilizando diferentes modelos in vitro e in vivo. Tamén avaliamos o efecto destes apósitos no ambiente da ferida e na cicatrización independente da infección. Para minimizar a influencia da matriz de administración, todos os apósitos de prata probados estaban compostos de carboximetilcelulosa.
A nosa avaliación preliminar destes apósitos de prata contra biofilmes coloniais de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus mostra que, a diferenza dos apósitos Ag1+ tradicionais, dous apósitos de prata avanzados, Ag1+ + EDTA/BC e sales de Ag osixenadas, son eficaces a 5. Eliminan eficazmente as bacterias do biofilm en poucos días. Ademais, estes apósitos impiden a reconstrución do biofilm tras a exposición repetida a bacterias planctónicas. O apósito Ag1+ contiña cloruro de prata, o mesmo composto de prata e matriz base que Ag1+ + EDTA/BC, e tivo un efecto limitado sobre a viabilidade bacteriana dentro do biofilm durante o mesmo período. A observación de que un apósito Ag1+ + EDTA/BC foi máis eficaz contra o biofilm que un apósito Ag1+ que consta da mesma matriz e un composto de prata apoia a idea de que se requiren ingredientes adicionais para aumentar a eficacia do cloruro de prata contra o biofilm, como se informou noutro lugar15. Estes resultados apoian a idea de que o BC e o EDTA desempeñan un papel adicional que contribúe á eficacia xeral dos apósitos e que a ausencia deste compoñente nos apósitos Ag1+ pode ter contribuído a que non se demostrase a eficacia in vitro. Descubrimos que os apósitos con sales de Ag osixenadas que producen ións Ag2+ e Ag3+ mostraron unha maior eficacia antibacteriana que o Ag1+ e a niveis similares aos de Ag1+ + EDTA/BC. Non obstante, debido ao alto potencial redox, non está claro canto tempo os ións Ag3+ permanecen activos e eficaces contra os biofilmes de feridas e, polo tanto, merecen un estudo máis profundo. Ademais, existen moitos apósitos diferentes que xeran ións Ag1+ que non se probaron neste estudo. Estes apósitos están compostos por diferentes compostos de prata, concentracións e matrices base, o que pode influír na subministración de ións Ag1+ e na súa eficacia contra os biofilmes. Tamén paga a pena sinalar que existen moitos modelos in vitro e in vivo diferentes que se utilizan para avaliar a eficacia dos apósitos para feridas contra os biofilmes. O tipo de modelo utilizado, así como o contido de sal e proteínas dos medios utilizados nestes modelos, influirán na eficacia do apósito. No noso modelo in vivo, deixamos que o biofilme madurase in vitro e despois transferímolo á superficie dérmica da ferida. A resposta inmunitaria do rato hóspede é relativamente eficaz contra as bacterias planctónicas aplicadas á ferida, formando así un biofilme a medida que a ferida cicatriza. A adición de biofilme maduro a unha ferida limita a eficacia da resposta inmunitaria do hóspede á formación de biofilme ao permitir que o biofilme maduro se estableza dentro da ferida antes de que poida comezar a cicatrización. Polo tanto, o noso modelo permítenos avaliar a eficacia dos apósitos antimicrobianos en biofilmes maduros antes de que as feridas comecen a cicatrizar.
Tamén descubrimos que o axuste do apósito influía na eficacia dos apósitos de prata en biopelículas cultivadas in vitro e pel porcina. O contacto próximo coa ferida considérase fundamental para a eficacia antimicrobiana do apósito24,25. Os apósitos que contiñan sales de Ag osixenadas estiveron en contacto próximo con biopelículas maduras, o que resultou nunha redución significativa no número de bacterias viables dentro da biopelícula despois de 24 horas. Pola contra, cando se trataron con apósitos Ag1+ e Ag1+ + EDTA/BC, permaneceu un número significativo de bacterias viables. Estes apósitos conteñen suturas ao longo de toda a lonxitude do apósito, o que crea espazos mortos que impiden o contacto próximo coa biopelícula. Nos nosos estudos in vitro, estas áreas sen contacto impediron a morte de bacterias viables dentro da biopelícula. Avaliamos a viabilidade bacteriana só despois de 24 horas de tratamento; Co tempo, a medida que o apósito se satura máis, pode haber menos espazo morto, o que reduce a área para estas bacterias viables. Non obstante, isto destaca a importancia da composición do apósito, non só do tipo de prata no apósito.
Aínda que os estudos in vitro son útiles para comparar a eficacia de diferentes tecnoloxías de prata, tamén é importante comprender os efectos destes apósitos nos biofilmes in vivo, onde o tecido hóspede e as respostas inmunitarias contribúen á eficacia dos apósitos contra os biofilmes. O efecto destes apósitos nos biofilmes de feridas observouse mediante microscopía electrónica de varrido e tinción EPS do biofilme utilizando colorantes de ADN intracelulares e extracelulares. Descubrimos que despois de 3 días de tratamento, todos os apósitos eran eficaces na redución do ADN libre de células en feridas infectadas con biofilme, pero o apósito Ag1+ foi menos eficaz en feridas infectadas por Staphylococcus aureus. A microscopía electrónica de varrido tamén mostrou que había significativamente menos bacterias presentes nas feridas tratadas cos apósitos de prata, aínda que isto foi máis pronunciado co apósito de sal de Ag osixenado e o apósito Ag1+ + EDTA/BC en comparación co apósito Ag1+. Estes datos amosan que os apósitos de prata probados tiveron diferentes graos de impacto na estrutura do biofilm, pero ningún dos apósitos de prata foi capaz de erradicar o biofilm, o que apoia a necesidade dunha abordaxe holística para o tratamento das infeccións de biofilm en feridas; uso de brazaletes de prata. O tratamento vai precedido dun desbridamento físico para eliminar a maior parte do biofilm.
As feridas crónicas adoitan presentar un estado de inflamación grave, cun exceso de células inflamatorias que permanecen no tecido da ferida durante un período de tempo prolongado, o que causa danos nos tecidos e reduce o osíxeno necesario para un metabolismo e unha función celular eficientes na ferida26. Os biofilmes exacerban este ambiente hostil da ferida ao afectar negativamente a cicatrización de diversas maneiras, incluíndo a inhibición da proliferación e migración celular e a activación de citocinas proinflamatorias27. A medida que os apósitos de prata se volven máis eficaces, é importante comprender o impacto que teñen no ambiente da ferida e na cicatrización.
Curiosamente, aínda que todos os apósitos de prata afectaron a composición do biofilm, só os apósitos de sales de prata osixenadas aumentaron a reepitelización destas feridas infectadas. Estes datos apoian os nosos achados previos17 e os de Kalan et al. (2017)28, que demostraron bos perfís de seguridade e toxicidade dos sales de prata osixenadas, xa que concentracións máis baixas de prata foron eficaces contra os biofilmes.
O noso estudo actual destaca as diferenzas na tecnoloxía da prata entre os apósitos antimicrobianos de prata e o impacto desta tecnoloxía no ambiente da ferida e na cicatrización independente da infección. Non obstante, estes resultados difiren de estudos previos que mostran que o apósito Ag1+ + EDTA/BC melloraba os parámetros de cicatrización das orellas de coello lesionadas in vivo. Non obstante, isto pode deberse a diferenzas nos modelos animais, os tempos de medición e os métodos de aplicación bacteriana29. Neste caso, as medicións da ferida tomáronse 12 días despois da lesión para permitir que os ingredientes activos do apósito actuasen sobre o biofilm durante un período de tempo máis longo. Isto está corroborado por un estudo que mostrou que as úlceras nas pernas clinicamente infectadas tratadas con Ag1+ + EDTA/BC aumentaron inicialmente de tamaño despois dunha semana de tratamento e, a continuación, durante as seguintes 3 semanas de tratamento con Ag1+ + EDTA/BC e dentro das 4 semanas posteriores ao uso de fármacos non antimicrobianos. Apósitos CMC para reducir o tamaño das úlceras30.
Xa se demostrou previamente que certas formas e concentracións de prata son citotóxicas in vitro 11 , pero estes resultados in vitro non sempre se traducen en efectos adversos in vivo . Ademais, os avances na tecnoloxía da prata e unha mellor comprensión dos compostos e concentracións de prata nos apósitos levaron ao desenvolvemento de moitos apósitos de prata seguros e eficaces. Non obstante, a medida que avanza a tecnoloxía dos apósitos de prata, é importante comprender o impacto destes apósitos no ambiente da ferida 31,32,33 . Informouse anteriormente de que o aumento da taxa de reepitelización corresponde a unha maior proporción de macrófagos M2 antiinflamatorios en comparación co fenotipo M1 proinflamatorio. Isto observouse nun modelo de rato anterior no que se compararon apósitos para feridas de hidrogel de prata con sulfadiazina de prata e hidrogeles non antimicrobianos 34 .
As feridas crónicas poden presentar unha inflamación excesiva e observouse que a presenza dun exceso de neutrófilos pode ser prexudicial para a cicatrización das feridas35. Nun estudo en ratos con depleción de neutrófilos, a presenza de neutrófilos atrasou a reepitelización. A presenza dun exceso de neutrófilos leva a altos niveis de proteases e especies reactivas de osíxeno, como o superóxido e o peróxido de hidróxeno, que están asociadas a feridas crónicas e de cicatrización lenta37,38. Do mesmo xeito, un aumento no número de macrófagos, se non se controla, pode levar a un atraso na cicatrización das feridas39. Este aumento é particularmente importante se os macrófagos non poden pasar dun fenotipo proinflamatorio a un fenotipo procicatrización, o que fai que as feridas non saian da fase inflamatoria da cicatrización40. Observamos unha diminución de neutrófilos e macrófagos en feridas infectadas con biopelícula despois de 3 días de tratamento con apósitos de prata, pero a diminución foi máis pronunciada cos apósitos de sal osixenado. Esta diminución pode ser un resultado directo da resposta inmunitaria á prata, unha resposta á diminución da biocarga ou que a ferida estea nunha fase posterior de cicatrización e, polo tanto, as células inmunitarias da ferida se reduzcan. A redución do número de células inflamatorias na ferida pode manter un ambiente propicio para a cicatrización das feridas. O mecanismo de acción de como os oxisales de Ag promoven a cicatrización independente da infección non está claro, pero a capacidade dos oxisales de Ag para producir osíxeno e destruír os niveis nocivos de peróxido de hidróxeno, un mediador da inflamación, pode explicar isto e require máis estudos17.
As feridas infectadas crónicas que non cicatrizan supoñen un problema tanto para os médicos como para os pacientes. Aínda que moitos apósitos afirman ter eficacia antimicrobiana, a investigación raramente se centra noutros factores clave que inflúen no microambiente da ferida. Este estudo demostra que as diferentes tecnoloxías da prata teñen unha eficacia antimicrobiana diferente e, o que é máis importante, diferentes efectos no ambiente da ferida e na cicatrización, independentemente da infección. Aínda que estes estudos in vitro e in vivo mostran a eficacia destes apósitos no tratamento de infeccións de feridas e na promoción da cicatrización, necesítanse ensaios controlados aleatorios para avaliar a eficacia destes apósitos na clínica.
Os conxuntos de datos empregados e/ou analizados durante o presente estudo están dispoñibles a través do autor correspondente se se solicitan con razoable solicitude.
Data de publicación: 15 de xullo de 2024