Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que está a usar ten soporte CSS limitado. Para obter os mellores resultados, recomendamos que use unha versión máis recente do seu navegador (ou desactiva o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir o apoio continuo, mostramos o sitio sen estilismo nin JavaScript.
O crecemento microbiano das feridas a miúdo maniféstase como biofilmas, que interfiren na curación e son difíciles de erradicar. Os novos apósitos de prata afirman combater as infeccións por feridas, pero xeralmente non se coñecen a súa eficacia de antibiofilm e os efectos curativos independentes da infección. Usando modelos de biofilm in vitro e in vivo de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, informamos da eficacia dos apósitos xeradores de ións AG1+; AP1+ apósitos que conteñen ácido etilendiaminetetraacético e cloruro de benzetonio (AG1+/EDTA/BC) e apósitos que conteñen nitrato de prata (AG Oxysalts). , que producen ións AG1+, AG2+ e AG3+ para combater o biofilm da ferida e o seu efecto na curación. Os apósitos AG1+ tiveron efectos mínimos no biofilm de feridas in vitro e en ratos (C57BL/6J). En contraste, as sales de AG osixenadas e os apósitos AG1+/EDTA/BC reduciron significativamente o número de bacterias viables en biofilmas in vitro e demostraron unha redución significativa dos compoñentes bacterianos e EPS nos biofilmas de feridas do rato. Estes apósitos tiveron diferentes efectos na curación de feridas infectadas con biofilm e non infectadas con biofilm, con apósitos de sal osixenados con efectos máis beneficiosos na reepitelialización, tamaño da ferida e inflamación en comparación cos tratamentos de control e outros apósitos de prata. As diferentes propiedades fisicoquímicas dos apósitos de prata poden ter diferentes efectos sobre o biofilm de feridas e a curación, e isto debe considerarse ao seleccionar un aderezo para o tratamento de feridas infectadas por biofilm.
As feridas crónicas defínense como "feridas que non progresan polas etapas normais de curación de xeito ordenado e oportuno" 1. As feridas crónicas crean unha carga psicolóxica, social e económica para os pacientes e o sistema sanitario. O gasto anual do NHS no tratamento de feridas e comorbilidades asociadas estímase en 8.300 millóns de libras en 2017-182. As feridas crónicas tamén son un problema imperioso nos Estados Unidos, con Medicare estimando o custo anual do tratamento de pacientes con feridas entre 28,1 e 96,8 millóns de dólares.
A infección é un factor importante para evitar a curación de feridas. As infeccións manifestan a miúdo como biofilmas, que están presentes no 78% das feridas crónicas non curadas. Os biofilmas fórmanse cando os microorganismos se unen irreversiblemente ás superficies, como as superficies da ferida, e poden agregarse para formar comunidades produtivas de polímero extracelular (EPS). O biofilm da ferida está asociado a un aumento da resposta inflamatoria provocando danos nos tecidos, que poden atrasar ou evitar a curación4. O aumento do dano dos tecidos pode deberse en parte ao aumento da actividade das metaloproteinases de matriz, colagenase, elastase e especies reactivas de osíxeno5. Por outra banda, as células inflamatorias e os biofilmas son eles mesmos consumidores altos de osíxeno e, polo tanto, poden causar hipoxia do tecido local, esgotando células do osíxeno vital necesario para a reparación efectiva do tecido6.
Os biofilmas maduros son altamente resistentes aos axentes antimicrobianos, requirindo estratexias agresivas para controlar as infeccións por biofilm, como o tratamento mecánico seguido dun tratamento antimicrobiano eficaz. Debido a que os biofilmas poden rexenerarse rapidamente, os antimicrobianos eficaces poden reducir o risco de re-formación despois do desbridamento cirúrxico7.
A prata úsase cada vez máis nos apósitos antimicrobianos e adoita usarse como tratamento de primeira liña para feridas infectadas crónicas. Hai moitos apósitos de prata dispoñibles comercialmente, cada un que contén unha composición, concentración de prata e matriz de base diferentes. Os avances nas brazaletes de prata levaron ao desenvolvemento de novas bandas de prata. A forma metálica de prata (AG0) é inerte; Para conseguir unha eficacia antimicrobiana, debe perder un electrón para formar prata iónica (AG1+). Os apósitos tradicionais de prata conteñen compostos de prata ou prata metálica que, cando están expostos ao líquido, se descompoñen para formar ións AG1+. Estes ións AG1+ reaccionan coa célula bacteriana, eliminando electróns de compoñentes estruturais ou procesos críticos necesarios para a supervivencia. A tecnoloxía patentada levou ao desenvolvemento dun novo composto de prata, AG oxisaltos (nitrato de prata, AG7NO11), que está incluído nos apósitos de feridas. A diferenza da prata tradicional, a descomposición de sales que conteñen osíxeno produce estados de prata con maior valencia (AG1+, AG2+e AG3+). Estudos in vitro demostraron que as baixas concentracións de sales de prata osixenadas son máis eficaces que a prata dun único ión (AG1+) contra bacterias patóxenas como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli8,9. Outro novo tipo de aderezo de prata inclúe ingredientes adicionais, é dicir, o ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) e o cloruro de benzetonio (BC), que se informan que dirixen o Biofilm EPS e aumentan así a penetración da prata no biofilm. Estas novas tecnoloxías de prata ofrecen novas formas de orientar os biofilms de feridas. Non obstante, o impacto destes antimicrobianos no ambiente da ferida e a curación independente da infección é importante para garantir que non creen un ambiente de feridas desfavorables nin retrasar a curación. Informáronse preocupacións sobre a citotoxicidade de prata in vitro con varios apósitos de prata 10,11. Non obstante, a citotoxicidade in vitro aínda non se traduciu en toxicidade in vivo, e varios apósitos AG1+ demostraron un bo perfil de seguridade12.
Aquí, investigamos a eficacia dos apósitos de carboximetilcelulosa que conteñen novas formulacións de prata contra o biofilm da ferida in vitro e in vivo. Ademais, avaliáronse os efectos destes apósitos sobre as respostas inmunes e a curación independente da infección.
Todos os apósitos empregados estaban dispoñibles comercialmente. 3M Kerracel Gel Fiber Fiber (3M, Knutsford, Reino Unido) é un aderezo de fibra de xel de 100% carboximetilcelulosa (CMC) non antimicrobiana que se usou como aderezo de control neste estudo. Valoráronse tres apósitos de prata antimicrobianos CMC, nomeadamente 3M Kerracel AG Aparder (3M, Knutsford, Reino Unido), que contén un 1,7%en peso. Sal de prata osixenada (AG7NO11) en ións de prata de maior valencia (AG1+, AG2+e AG3+). Durante a descomposición de ións AG7NO11, AG1+, AG2+ e AG3+ fórmanse nunha proporción de 1: 2: 4. Aquacel AG aderezo extra que contén cloruro de prata 1,2% (AG1+) (Convatec, Deeside, Reino Unido) 13 e Aquacel AG+aderezo extra que contén 1,2% de cloruro de prata (AG1+), EDTA e cloruro de benzetonio (Convatec, Deeside, Reino Unido) 14.
As cepas utilizadas neste estudo foron Pseudomonas Aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) e Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
As bacterias cultiváronse durante a noite no caldo de Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Reino Unido). A cultura durante a noite foi entón diluída 1: 100 en caldo de Mueller-Hinton e 200 µl placado en estéril 0,2 µm Whatman Cyclopore Membranes (Whatman Plc, Maidstone, Reino Unido) en Mueller-Hinton Agar placas (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Gran Britain ). ) Formación de biofilm colonial a 37 ° C durante 24 horas. Estes biofilmas coloniais probáronse para o encollemento logarítmico.
Cortar o aderezo en anacos cadrados de 3 cm2 e pre-moisten con auga desionizada estéril. Coloque o vendaje sobre o biofilm da colonia na placa de ágar. Elimináronse cada 24 ha de biofilm e as bacterias viables dentro do biofilm (CFU/ml) cuantificáronse mediante dilución en serie (10-1 a 10-7) no caldo de neutralización do ángulo de día (Merck-Millipore). Despois de 24 horas de incubación a 37 ° C, realizáronse contas de placas estándar en placas de ágar Mueller-Hinton. Cada tratamento e punto de tempo realizouse por triplicado e repetíronse o número de placas para cada dilución.
A pel da barriga de porco obtense de porcos brancos grandes femininos aos 15 minutos da matanza de acordo coas normas de exportación da Unión Europea. A pel foi afeitada e limpada con toallitas de alcol, logo conxelada a -80 ° C durante 24 horas para desvitalizar a pel. Despois do descongelamento, laváronse 1 anacos de pel de 1 cm2 con PBS, hipoclorito sódico 0,6% e etanol 70% durante 20 minutos cada vez. Antes de eliminar a epiderme, elimine calquera etanol restante lavando 3 veces en PBS estéril. A pel cultivouse nunha placa de 6 pozos cunha membrana de nylon de 0,45 μm de grosor (Merck-Millipore) na parte superior e 3 almofadas absorbentes (Merck-Millipore) que contiñan 3 ml de soro bovino fetal (Sigma) complementado con 10% Dulbecco modificado modificado Aguia. Medio (Eagle modificado de Dulbecco - Aldrich Ltd.).
Os biofilmas coloniais cultiváronse como se describe para estudos de exposición ao biofilm. Despois de cultivar o biofilm na membrana durante 72 horas, o biofilm aplicouse á superficie da pel mediante un bucle de inoculación estéril e eliminouse a membrana. O biofilm foi entón incubado na derme do porco durante 24 horas adicionais a 37 ° C para permitir que o biofilm maduro e se adhira á pel do porco. Despois de que o biofilm madurara e unido, aplicouse un aderezo de 1,5 cm2, pre-lamentado con auga destilada estéril, á superficie da pel e incubouse a 37 ° C durante 24 horas. As bacterias viables visualizáronse mediante a tinción aplicando uniformemente o reactivo de viabilidade das células Prestoblue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) á superficie apical de cada explotación e incubándoa durante 5 minutos. Use a cámara dixital Leica DFC425 para capturar instantaneamente imaxes no microscopio Leica MZ8. As áreas de cor de cor foron cuantificadas mediante a versión 10 de software Image Pro (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)). A microscopía electrónica de dixitalización realizouse como se describe a continuación.
As bacterias cultivadas durante a noite diluíronse 1: 100 no caldo de Mueller-Hinton. Engadiuse 200 μL de cultivo a unha membrana ciclopore de 0,2 μm estéril (Whatman, Maidstone, Reino Unido) e plasmada en Mueller-Hinton Agar. As placas de biofilm foron incubadas a 37 ° C durante 72 horas para permitir a formación de biofilm madura.
Despois de 3 días de maduración de biofilm, colocouse un vendaje cadrado de 3 cm2 directamente no biofilm e incubouse a 37 ° C durante 24 horas. Despois de eliminar o vendaje da superficie de biofilm, engadiuse 1 ml de reactivo de viabilidade das células Prestoblue (Invitrogen, Waltham, MA) á superficie de cada biofilm durante 20 segundos. As superficies secáronse antes de que se rexistraran os cambios de cor usando unha cámara dixital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Reino Unido).
Prepare cultivos durante a noite en Mueller-Hinton Agar, transfire colonias individuais a 10 ml de caldo de Mueller-Hinton e incubar a un axitador a 37 ° C (100 rpm). Despois da incubación durante a noite, a cultura diluíuse 1: 100 en caldo de Mueller-Hinton e 300 µl foi descuberta en 0,2 µm circular Whatman Cyclopore Membrana (Whatman International, Maidstone, Reino Unido) en Mueller-Hinton Agar e incubado a 37 ° C dentro de 72 horas . . O biofilm maduro aplicouse á ferida como se describe a continuación.
Todos os traballos con animais leváronse a cabo na Universidade de Manchester baixo unha licenza de proxecto aprobada pola Oficina de Benestar Animal e Revisión Ethical (P8721BD27) e de acordo coas directrices publicadas pola Oficina de Interior no ASPA revisado en 2012. Todos os autores adheríronse ás directrices de chegada. Os ratos C57BL/6J de oito semanas (Envigo, Oxon, Reino Unido) utilizáronse para todos os estudos in vivo. Os ratos foron anestesiados con isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Reino Unido) e as súas superficies dorsais foron afeitadas e limpadas. A cada rato recibíuselle unha ferida excisional de 2 × 6 mm usando un golpe de biopsia de Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Reino Unido). Para as feridas infectadas por biofilm, aplique un biofilm colonial de 72 horas cultivado na membrana como se describe anteriormente na capa dérmica da ferida usando un bucle de inoculación estéril inmediatamente despois da lesión e descarta a membrana. Un centímetro cadrado de aderezo está pre-lóxico con auga estéril para manter un ambiente de feridas húmidas. Aplicábanse apósitos directamente a cada ferida e cubertas con película de Tegaderm de 3M (3M, Bracknell, Reino Unido) e adhesivo líquido mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicados ao redor dos bordos para proporcionar unha adhesión adicional. A buprenorfina (AnimalCare, York, Reino Unido) administrouse a unha concentración de 0,1 mg/kg como analxésica. Caza de ratos tres días despois da lesión mediante o método da Lista 1 e elimina, á metade e garde a zona da ferida segundo sexa necesario.
A tinción de hematoxilina (Thermofisher Scientific) e Eosin (Thermofisher Scientific) realizouse segundo o protocolo do fabricante. A área de ferida e a reepitelialización cuantificáronse mediante a versión 10 do software Image Pro (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
As seccións de tecidos foron desordenadas en xileno (Thermofisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), rehidratouse con etanol graduado do 100-50% e inmersa brevemente en auga desionizada (Thermofisher Scientific). A inmunohistoquímica realizouse usando o kit Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) segundo o protocolo do fabricante. Os anticorpos primarios a neutrófilos NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) e macrófagos MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) diluíronse 1: 100 en solución de bloqueo e engadíronse á superficie cortada, seguidos de 2 anticorpos anticorpos anti-, Vectastain ABC e Vector Nova Kit de substrato de peroxidasa vermella (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e contabilizado con hematoxilina. As imaxes foron adquiridas mediante un microscopio Olympus BX43 e unha cámara dixital Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Reino Unido).
As mostras de pel fixáronse en 2,5% de glutaraldehído e un 4% de formaldehído en 0,1 M HEPES (pH 7,4) durante 24 horas a 4 ° C. As mostras foron deshidratadas usando etanol graduado e secáronse en CO2 usando un secador de puntos críticos de quórum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Reino Unido) e revestido de pulverización con aliaxe de paladio de ouro mediante un sistema de descarga de sputterer de quórum SC7620. Os exemplares fixéronse imaxinados mediante un microscopio electrónico de dixitalización FEI Quanta 250 (Thermofisher Scientific) para visualizar o punto central da ferida.
O ioduro ToTO-1 (2 μM) aplicouse á superficie da ferida do rato exciso e incubouse durante 5 min a 37 ° C (Thermofisher Scientific) e tratouse con Syto-60 (10 μM) a 37 ° C (Thermofisher Scientific). As imaxes de pila Z de 15 minutos creáronse usando un Leica TCS SP8.
Os datos de replicación biolóxica e técnica foron tabulados e analizados mediante o software GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). A análise unidireccional da varianza con múltiples comparacións mediante a proba post hoc de Dunnett utilizouse para probar as diferenzas entre cada tratamento e o aderezo de control non antimicrobiano. Considerouse significativo un valor P <0,05.
A eficacia dos apósitos fibrosos de xel de prata avaliouse por primeira vez contra as colonias de biofilm de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa in vitro. Os apósitos de prata conteñen diferentes fórmulas de prata: os apósitos tradicionais de prata producen ións AG1+; Os apósitos de prata, que poden producir ións AG1+ despois da adición de EDTA/BC, poden destruír a matriz de biofilm e expoñer bacterias á prata baixo o efecto antibacteriano da prata. ións 15 e apósitos que conteñen sales de AG osixenadas que producen ións AG1+, AG2+ e AG3+. A súa eficacia foi comparada cun aderezo de control non antimicrobiano feito de fibras xeladas. As bacterias viables restantes dentro do biofilm foron avaliadas cada 24 horas durante 8 días (figura 1). O día 5, o biofilm foi reinoculado con 3,85 × 105. Staphylococcus aureus ou 1,22 × 105p. aeruginosa para avaliar a recuperación de biofilm. En comparación cos apósitos de control non antimicrobianos, os apósitos AG1+ tiveron un efecto mínimo na viabilidade bacteriana en Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa biofilmas durante 5 días. En contraste, os apósitos que conteñen as sales de AG e AG1 + + EDTA/BC osixenados foron eficaces para matar bacterias dentro do biofilm dentro de 5 días. Despois de repetir a inoculación con bacterias planctónicas o día 5, non se observou ningunha restauración do biofilm (Fig. 1).
Cuantificación de bacterias viables en staphylococcus aureus e pseudomonas aeruginosa biofilmas despois do tratamento con apósitos de prata. As colonias de biofilm de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa foron tratadas con apósitos de prata ou apósitos de control non antimicrobianos, e o número de bacterias viables que quedaban quedou cada 24 horas. Despois de 5 días, o biofilm foi reinoculado con 3,85 × 105. Staphylococcus aureus ou 1,22 × 105p. As colonias do bacterioplancton pseudomonas aeruginosa formáronse individualmente para avaliar a recuperación de biofilm. Os gráficos mostran un erro estándar +/- estándar.
Para visualizar o efecto dos apósitos de prata na viabilidade do biofilm, aplicáronse apósitos a biofilmas maduros cultivados na pel porcina ex vivo. Despois de 24 horas, elimínase o aderezo e o biofilm está manchado cun colorante reactivo azul, que se metaboliza por bacterias vivas a unha cor rosa. Os biofilmas tratados con apósitos de control eran de cor rosa, o que indica a presenza de bacterias viables dentro do biofilm (Figura 2A). En contraste, o biofilm tratado co aderezo de AG oxisols era principalmente azul, o que indica que as bacterias restantes na superficie da pel do porco eran bacterias non viables (figura 2b). A coloración azul mixta e rosa foi observada en biofilmas tratados con apósitos que contén AG1+, o que indica a presenza de bacterias viables e non viables dentro do biofilm (figura 2C), mentres que os apósitos EDTA/BC que conteñen AG1+ eran predominantemente azul con algúns puntos rosa. indicando zonas non afectadas polo aderezo de prata (figura 2D). A cuantificación de áreas activas (rosa) e inactiva (azul) demostraron que o parche de control era un 75% activo (Figura 2E). Os apósitos AG1 + + EDTA/BC realizáronse de xeito similar aos apósitos de sal osixenados, con taxas de supervivencia do 13% e 14%, respectivamente. O aderezo AG1+ tamén reduciu a viabilidade bacteriana nun 21%. Estes biofilmas foron observados mediante microscopía electrónica de dixitalización (SEM). Despois do tratamento co aderezo de control e o aderezo AG1+, observouse unha capa de Pseudomonas aeruginosa cubrindo a pel porcina (Figura 2F, H), mentres que despois do tratamento co aderezo AG1+, atopáronse poucas células bacterianas e se atoparon poucas células bacterianas debaixo. As fibras de coláxeno poden considerarse como a estrutura do tecido da pel porcina (figura 2G). Despois do tratamento con aderezo AG1 + + EDTA/BC, foron visibles as placas bacterianas e as placas de fibra de coláxeno subxacentes (figura 2i).
Visualización de Pseudomonas Aeruginosa Biofilm despois do tratamento de aderezo de prata. (A-D) Viabilidade bacteriana en Pseudomonas Aeruginosa Os biofilmas cultivados na pel porcina visualizáronse usando un colorante de viabilidade prestoblue 24 horas despois do tratamento con apósitos de prata ou apósitos de control non antimicrobianos. As bacterias vivas son rosas, as bacterias non viables e a pel de porco son azuis. (E) Cuantificación de biofilmas de Pseudomonas Aeruginosa cultivados na pel porcina (mancha rosa) usando a microscopía electrónica de microscopía electrónica Pro Versión 10 (FI) e tratada cun aderezo de prata ou un aderezo de control non antimicrobiano durante 24 horas. Barra de escala SEM = 5 µm. (J - M) Os biofilmas coloniais creceron en filtros e foron manchados con colorante reactivo de Prestoblue despois de 24 h de incubación con apósitos de prata.
Para determinar se un estreito contacto entre os apósitos e os biofilmas afectou a eficacia dos apósitos, tratáronse os biofilmas coloniais colocados nunha superficie plana cos apósitos durante 24 horas e logo mancháronse con colorantes reactivos. O biofilm non tratado era de cor rosa escuro (figura 2J). En contraste cos biofilmas tratados con apósitos que conteñen sales de AG osixenadas (figura 2K), biofilmas tratados con apósitos que conteñen AG1+ ou Ag1++ EDTA/BC mostraban bandas de tinción rosa (figura 2L, M). Esta coloración rosa indica a presenza de bacterias viables e está asociada á área de sutura dentro do aderezo. Estas áreas cosidas crean espazos mortos que permiten sobrevivir as bacterias dentro do biofilm.
Para avaliar a eficacia dos apósitos de prata in vivo, as feridas excitadas de ratos infectados con biofilmas de S. aureus e P. aeruginosa foron tratados con biofilmas de P. aeruginosa con apósitos de control non antimicrobianos ou apósitos de prata. Despois de 3 días de tratamento, a análise de imaxes macroscópicas mostrou tamaños de ferida máis pequenos cando se tratan con apósitos de sal osixenados en comparación con apósitos de control non antimicrobianos e outros apósitos de prata (figura 3A-H). Para confirmar estas observacións, as feridas foron colleitadas e cuantificáronse a área de feridas e a reepitelialización en seccións de tecido manchado de hematoxilina e eosina usando a versión 10 de software de imaxe (Figura 3I-L).
O efecto dos apósitos de prata na superficie da ferida e a reepitelialización de feridas infectadas con biofilmas. (A - H) Pequenas células infectadas con biofilmas de Pseudomonas aeruginosa (A - D) e Staphylococcus aureus (E - H) despois de tres días de tratamento cun aderezo de control non antimicrobiano, un vestiario de AG oxixenado, un aderezo AG1+ e un AG1+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ vestido. Imaxes macroscópicas representativas. Feridas de ratos con aderezo AG1 + + EDTA/BC. (IL) Infección representativa de Pseudomonas aeruginosa, seccións histolóxicas manchadas de hematoxilina e eosina, usadas para cuantificar a área de ferida e a rexeneración epitelial. Cuantificación da área de ferida (M, O) e a reepitelialización porcentual (N, P) de feridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa (M, N) e Staphylococcus aureus (O, P) biofilmas (por grupo de tratamento n = 12). Os gráficos mostran un erro estándar +/- estándar. * significa p = <0.05 ** significa p = <0.01; Escala macroscópica = 2,5 mm, escala histolóxica = 500 µm.
A cuantificación da área de feridas en feridas infectadas con pseudomonas aeruginosa biofilm (figura 3m) demostrou que as feridas tratadas con oxisaltos de AG tiñan un tamaño medio de ferida de 2,5 mm2, mentres que o aderezo non antimicrobiano tiña un tamaño medio de ferida de 3,1 mm2, o que non é o que non verdade. alcanzou a importancia estatística (figura 3M). P = 0,423). As feridas tratadas con AG1+ ou AG1++ EDTA/BC non mostraron redución da área da ferida (3,1 mm2 e 3,6 mm2, respectivamente). O tratamento con aderezo de sal osixenado promoveu a reepitelialización en maior medida que o aderezo de control non antimicrobiano (34% e 15%, respectivamente; P = 0,029) e AG1+ ou AG1++ EDTA/BC (10% e 11%) ( Figura 3n). . , respectivamente).
Tendencias similares na área de ferida e rexeneración epitelial observáronse en feridas infectadas con biofilmas de S. aureus (Figura 3O). Os apósitos que conteñen sales de prata osixenadas reducían a zona de ferida (2,0 mm2) nun 23% en comparación co aderezo non antimicrobiano de control (2,6 mm2), aínda que esta redución non foi significativa (P = 0,304) (Fig. 3O). Ademais, a área de ferida do grupo de tratamento AG1+ reduciuse lixeiramente (2,4 mm2), mentres que a ferida tratada con aderezo AG1++ EDTA/BC non reduciu a zona da ferida (2,9 mm2). As sales de osíxeno de AG tamén promoveron a reepitelialización de feridas infectadas con biofilm de S. aureus (31%) en maior medida que as tratadas con apósitos de control non antimicrobianos (12%, p = 0,003) (figura 3p). O aderezo AG1+ (16%, P = 0,903) e AG+ 1+ APPERSING EDTA/BC (14%, P = 0,965) mostraron niveis de rexeneración epitelial similares ao control.
Para visualizar o efecto dos apósitos de prata na matriz de biofilm, realizouse Toto 1 e Syto 60 ioduro de tinción de ioduro (Fig. 4). O ioduro TOTO 1 é un colorante inmpermeable ás células que se pode usar para visualizar con precisión os ácidos nucleicos extracelulares, que son abundantes no EPS de biofilmas. Syto 60 é un colorante permeable ás células usado como contratista16. As observacións de Toto 1 e Syto 60 ioduro en feridas inoculadas con biofilmas de Pseudomonas aeruginosa (figura 4A-D) e Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) demostrou que despois de 3 días de tratamento, o EPS no biofilm reduciuse significativamente. que contén sales osixenados AG e AG1 + + EDTA/BC. Os apósitos AG1+ sen compoñentes de antibiofilm adicionais reduciron significativamente o ADN libre de células en feridas inoculadas con Pseudomonas aeruginosa, pero eran menos eficaces en feridas inoculadas con Staphylococcus aureus.
Imaxe in vivo de biofilm de feridas despois de 3 días de tratamento con control de control ou prata. Imaxes confocais de Pseudomonas aeruginosa (A - D) e Staphylococcus aureus (I - L) manchadas con Toto 1 (verde) para visualizar ácidos nucleicos extracelulares, un compoñente de polímeros de biofilm extracelulares. Para manchar ácidos nucleicos intracelulares, use Syto 60 (vermello). ácidos. P. Microscopía electrónica de dixitalización de feridas infectadas con biofilmas de Pseudomonas Aeruginosa (E - H) e Staphylococcus aureus (M - P) despois de 3 días de tratamento con apósitos de control e prata. Barra de escala SEM = 5 µm. Barra de escala de imaxe confocal = 50 µm.
A microscopía electrónica de dixitalización demostrou que os ratos inoculados con colonias de biofilm de Pseudomonas aeruginosa (figura 4E-H) e Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) tiña bastante menos bacterias nas súas feridas despois de 3 días de tratamento con todos os apósitos de prata.
Para avaliar o efecto dos apósitos de prata sobre a inflamación da ferida en ratos infectados con biofilm, seccións de feridas infectadas por biofilm tratadas con control de control ou prata durante 3 días foron manchadas inmunohistoquímicamente usando anticorpos específicos para neutrófilos e macrófagos. Determinación cuantitativa de neutrófilos e macrófagos internamente. tecido de granulación. Figura 5). Todos os apósitos de prata reduciron o número de neutrófilos e macrófagos en feridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa en comparación cos apósitos de control non antimicrobianos despois de tres días de tratamento. Non obstante, o tratamento co aderezo de sal de prata osixenado deu lugar a unha maior redución de neutrófilos (p = <0,0001) e macrófagos (P = <0,0001) en comparación con outros apósitos de prata probados (Figura 5i, J). Aínda que AG1++ EDTA/BC tivo un maior efecto no biofilm da ferida, reduciu en menor medida os niveis de neutrófilos e macrófagos en menor medida que o aderezo AG1+. Tamén se observaron feridas moderadas infectadas con biofilm de S. aureus despois de vestirse con AG (P = <0,0001), AG1+ (P = 0,0008) e AG1 ++ EDTA/BC (P = 0,0043) oxisoles en comparación co control. Obsérvanse tendencias similares para a neutropenia. Bandage (Fig. 5K). Non obstante, só o aderezo de sal osíxeno mostrou unha redución significativa do número de macrófagos no tecido de granulación en comparación co control das feridas infectadas con biofilmas de S. aureus (p = 0,0339) (figura 5L).
Os neutrófilos e os macrófagos cuantificáronse en feridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus biofilms despois de 3 días de tratamento con control non antimicrobiano ou apósitos de prata. Os neutrófilos (AD) e os macrófagos (EH) cuantificáronse en seccións de tecidos manchados con anticorpos específicos para neutrófilos ou macrófagos. Cuantificación de neutrófilos (I e K) e macrófagos (J e L) en feridas infectadas con biofilmas de Pseudomonas aeruginosa (I e J) e Staphylococcus aureus (K&L). N = 12 por grupo. Os gráficos mostran un erro estándar +/- estándar, valores de significación en comparación co aderezo de control non antibacteriano, * significa p = <0.05, ** significa p = <0.01; *** significa p = <0,001; indica p = <0,0001).
A continuación, avaliamos o efecto dos apósitos de prata na curación independente da infección. As feridas excisionais non infectadas foron tratadas cun aderezo de control non antimicrobiano ou un aderezo de prata durante 3 días (figura 6). Entre os apósitos de prata probados, só as feridas tratadas co aderezo de sal osixenado apareceron máis pequenas en imaxes macroscópicas que as feridas tratadas co control (Figura 6A-D). A cuantificación da área de feridas mediante análises histolóxicas demostrou que a superficie media da ferida despois do tratamento co aderezo de AG oxisols foi de 2,35 mm2 fronte a 2,96 mm2 para feridas tratadas co grupo control, pero esta diferenza non alcanzou a importancia estatística (P = 0,488) (Fig . En contraste, non se observou ningunha redución da área da ferida despois do tratamento con AG1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ou apósitos AG1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) en comparación co grupo control. Observouse un aumento da rexeneración epitelial co aderezo de AG oxisol en comparación co grupo control (30% fronte ao 22%, respectivamente), aínda que isto non alcanzou importancia (P = 0,067), isto é bastante significativo e confirma os resultados anteriores. Un aderezo con oxisolos promove a reepitelialización. -Epitelización de feridas non infectadas17. En contraste, o tratamento con apósitos AG1+ ou AG1++ EDTA/BC non tivo efecto nin mostrou unha diminución da reepitelialización en comparación co control.
Efecto do aderezo de feridas de prata na curación de feridas en ratos desinfectados con resección completa. (AD) Imaxes macroscópicas representativas de feridas despois de tres días de tratamento cun aderezo de control non antimicrobiano e un aderezo de prata. (EH) Seccións de feridas representativas manchadas con hematoxilina e eosina. A cuantificación da área de ferida (I) e a porcentaxe de reepitelialización (J) calculáronse a partir de seccións histolóxicas no punto medio da ferida mediante software de análise de imaxes (n = 11–12 por grupo de tratamento). Os gráficos mostran un erro estándar +/- estándar. * significa p = <0.05.
A prata ten unha longa historia de uso como terapia antimicrobiana na curación de feridas, pero as moitas formulacións e métodos de entrega diferentes poden producir diferenzas na eficacia antimicrobiana 18. Ademais, as propiedades antibiofilm de sistemas específicos de entrega de prata non se entenden completamente. Aínda que a resposta inmune do hóspede é relativamente eficaz contra as bacterias planctónicas, normalmente é menos eficaz contra os biofilms19. As bacterias planctónicas son facilmente fagocitadas por macrófagos, pero dentro dos biofilmas, as células agregadas supoñen problemas adicionais ao limitar a resposta do hóspede na medida en que as células inmunes poden sufrir apoptose e liberar factores proinflamatorios para mellorar a resposta inmune20. Observouse que algúns leucocitos poden penetrar en biofilms21 pero non son capaces de facer bacterias fagocitose unha vez que esta defensa está comprometida22. Debe empregarse un enfoque holístico para apoiar a resposta inmune do hóspede contra a infección por biofilm de feridas. O desbridamento da ferida pode perturbar físicamente o biofilm e eliminar a maior parte do bioburden, pero a resposta inmune do hóspede pode ser ineficaz contra o biofilm restante, especialmente se a resposta inmune do hóspede está comprometida. Así, as terapias antimicrobianas como os apósitos de prata poden apoiar a resposta inmune do hóspede e eliminar as infeccións por biofilm. A composición, a concentración, a solubilidade e o substrato de entrega poden influír na eficacia antimicrobiana da prata. Nos últimos anos, os avances na tecnoloxía de procesamento de prata fixeron que estes apósitos sexan máis efectivos en 9,23. A medida que avanza a tecnoloxía de vestiario de prata, é importante comprender a eficacia destes apósitos para controlar a infección das feridas e, máis importante, o impacto destas formas potentes de prata no ambiente da ferida e na curación.
Neste estudo, comparamos a eficacia de dous apósitos avanzados de prata con apósitos de prata convencionais que producen ións AG1+ contra biofilmas usando diferentes modelos in vitro e in vivo. Tamén evaluamos o efecto destes apósitos sobre o ambiente da ferida e a curación independente da infección. Para minimizar a influencia da matriz de entrega, todos os apósitos de prata probados estaban compostos por carboximetilcelulosa.
A nosa avaliación preliminar destes apósitos de prata contra biofilmas coloniais de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus demostra que, a diferenza dos apósitos tradicionais AG1+, dous apósitos de prata avanzados, AG1++ EDTA/BC e sales de AG osixenados, son efectivos en 5. Matan eficazmente as bacterias biofilmmas en dentro dentro de dentro dentro de dentro dentro de dentro dentro de dentro dentro de dentro dentro de dentro dentro de 5. uns días. Ademais, estes apósitos impiden a formación de biofilm despois da exposición repetida a bacterias planctónicas. O aderezo AG1+ contiña cloruro de prata, o mesmo composto de prata e matriz base que AG1++ EDTA/BC, e tivo un efecto limitado sobre a viabilidade bacteriana dentro do biofilm durante o mesmo período. A observación de que un aderezo AG1++ EDTA/BC foi máis eficaz contra o biofilm que un aderezo AG1+ composto pola mesma matriz e un composto de prata soporta a idea de que se necesitan ingredientes adicionais para aumentar a eficacia do cloruro de prata contra o biofilm, como se informou noutro lugar15. Estes resultados apoian a idea de que BC e EDTA xogan un papel adicional que contribúe á eficacia do vestiario global e que a ausencia deste compoñente nos apósitos AG1+ pode ter contribuído ao non demostrar eficacia in vitro. Descubrimos que os apósitos de sal osixenados que producían ións AG2+ e AG3+ presentaban unha eficacia antibacteriana máis forte que AG1+ e a niveis similares a AG1++ EDTA/BC. Non obstante, debido ao alto potencial redox, non está claro canto tempo permanecen activos e eficaces contra os biofilmas de feridas e, polo tanto, merecen un maior estudo. Ademais, hai moitos apósitos diferentes que xeran ións AG1+ que non se probaron neste estudo. Estes apósitos están compostos por diferentes compostos de prata, concentracións e matrices de base, que poden influír na entrega de ións AG1+ e a súa eficacia contra os biofilmas. É importante salientar que hai moitos modelos diferentes in vitro e in vivo empregados para avaliar a eficacia dos apósitos de feridas contra biofilmas. O tipo de modelo empregado, así como o contido de sal e proteínas dos medios empregados nestes modelos, influirá na eficacia do aderezo. No noso modelo in vivo, permitimos que o biofilm madurase in vitro e logo o trasladamos á superficie dérmica da ferida. A resposta inmune do rato hóspede é relativamente eficaz contra as bacterias planctónicas aplicadas á ferida, formando así un biofilm a medida que a ferida cura. A adición de biofilm maduro a unha ferida limita a eficacia da resposta inmune do hóspede á formación de biofilm permitindo que o biofilm maduro se estableza dentro da ferida antes de que poida comezar a curación. Así, o noso modelo permítenos avaliar a eficacia dos apósitos antimicrobianos en biofilmas maduros antes de que as feridas comecen a curar.
Tamén descubrimos que o vestiario influíu na eficacia dos apósitos de prata en biofilmas de cultivo in vitro e pel porcina. O estreito contacto coa ferida considérase crítico para a eficacia antimicrobiana do vestiario24,25. Os apósitos que conteñen sales de AG osixenadas estaban en estreito contacto con biofilmas maduros, obtendo unha redución significativa do número de bacterias viables dentro do biofilm despois de 24 horas. En contraste, cando se tratan con apósitos AG1+ e AG1++ EDTA/BC, mantivéronse un número significativo de bacterias viables. Estes apósitos conteñen suturas ao longo de toda a lonxitude do aderezo, o que crea espazos mortos que evitan un contacto estreito co biofilm. Nos nosos estudos in vitro, estas áreas sen contacto impediron a morte de bacterias viables dentro do biofilm. Avaliamos a viabilidade bacteriana só despois de 24 horas de tratamento; Co tempo, a medida que o aderezo se sature máis, pode haber menos espazo morto, reducindo a zona para estas bacterias viables. Non obstante, isto pon de manifesto a importancia da composición do aderezo, non só o tipo de prata no aderezo.
Aínda que os estudos in vitro son útiles para comparar a eficacia de diferentes tecnoloxías de prata, tamén é importante comprender os efectos destes apósitos nos biofilmas in vivo, onde o tecido hóspede e as respostas inmunes contribúen á eficacia dos apósitos contra os biofilmas. O efecto destes apósitos sobre biofilmas de feridas foi observado mediante microscopía electrónica de dixitalización e tinción de EPS do biofilm usando colorantes de ADN intracelulares e extracelulares. Descubrimos que despois de 3 días de tratamento, todos os apósitos foron eficaces para reducir o ADN libre de células en feridas infectadas por biofilm, pero o aderezo AG1+ foi menos eficaz nas feridas infectadas por Staphylococcus aureus. A microscopía electrónica de dixitalización tamén demostrou que estaban presentes significativamente menos bacterias en feridas tratadas cos apósitos de prata, aínda que isto foi máis pronunciado co aderezo de sal de AG osixenado e o aderezo AG1++ EDTA/BC en comparación co aderezo AG1+. Estes datos mostran que os apósitos de prata probados tiñan diferentes graos de impacto na estrutura de biofilm, pero ningún dos apósitos de prata foi capaz de erradicar o biofilm, apoiando a necesidade dun enfoque holístico para o tratamento de infeccións por biofilm de feridas; Uso de brazaletes de prata. O tratamento está precedido do desbridamento físico para eliminar a maior parte do biofilm.
As feridas crónicas adoitan estar nun estado de inflamación grave, co exceso de células inflamatorias que quedan no tecido da ferida durante un período prolongado de tempo, causando danos nos tecidos e esgotando o osíxeno necesario para un metabolismo celular e unha función eficientes na ferida26. Os biofilmas agravan este ambiente de feridas hostís afectando negativamente a curación de varias formas, incluída a inhibición da proliferación celular e a migración e a activación de citocinas proinflamatorias27. A medida que os apósitos de prata se fan máis efectivos, é importante comprender o impacto que teñen no ambiente da ferida e a curación.
Curiosamente, aínda que todos os apósitos de prata afectaron a composición de biofilm, só os apósitos de sal de prata osixenados aumentaron a re-epitelialización destas feridas infectadas. Estes datos admiten os nosos resultados anteriores17 e os de Kalan et al. (2017) 28, que demostraron unha boa seguridade e perfís de toxicidade de sales de prata osixenadas, xa que as concentracións máis baixas de prata foron efectivas contra os biofilmas.
O noso estudo actual pon de manifesto as diferenzas na tecnoloxía de prata entre os apósitos de prata antimicrobianos e o impacto desta tecnoloxía no ambiente da ferida e a curación independente da infección. Non obstante, estes resultados difiren de estudos anteriores que demostran que o aderezo AG1 + + EDTA/BC mellorou os parámetros de curación das orellas de coello feridas in vivo. Non obstante, isto pode deberse a diferenzas nos modelos animais, os tempos de medición e os métodos de aplicación bacteriana29. Neste caso, tomáronse medicións de feridas 12 días despois da lesión para permitir que os ingredientes activos do aderezo actúen no biofilm durante un período de tempo máis longo. Isto é apoiado por un estudo que demostrou que as úlceras de pernas infectadas clínicamente tratadas con AG1 + + EDTA/BC aumentaron inicialmente de tamaño despois dunha semana de tratamento, e logo durante as próximas 3 semanas de tratamento con AG1 + + EDTA/BC e dentro das 4 semanas despois Uso de non antimicrobianos. drogas. Apósitos CMC para reducir o tamaño das úlceras30.
Algunhas formas e concentracións de prata demostraron anteriormente que son citotóxicas in vitro 11, pero estes resultados in vitro non sempre se traducen en efectos adversos in vivo. Ademais, os avances na tecnoloxía de prata e unha mellor comprensión dos compostos e concentracións de prata nos apósitos levaron ao desenvolvemento de moitos apósitos de prata seguros e eficaces. Non obstante, a medida que avanza a tecnoloxía de vestiario de prata, é importante comprender o impacto destes apósitos no ambiente da ferida31,32,33. Informouse anteriormente de que a taxa aumentada de reepitelialización corresponde a unha maior proporción de macrófagos M2 antiinflamatorios en comparación co fenotipo M1 proinflamatorio. Isto notouse nun modelo anterior de rato onde se compararon os apósitos de ferida de hidrogel de prata con sulfadiazina de prata e hidrogeles non antimicrobianos34.
As feridas crónicas poden presentar unha inflamación excesiva e observouse que a presenza de exceso de neutrófilos pode ser prexudicial para a curación de feridas35. Nun estudo en ratos esgotados por neutrófilos, a presenza de neutrófilos atrasou a reepitelialización. A presenza de exceso de neutrófilos leva a altos niveis de proteases e especies reactivas de osíxeno, como o superóxido e o peróxido de hidróxeno, que están asociados a feridas crónicas e de curación lenta37,38. Do mesmo xeito, un aumento dos números de macrófagos, se non está controlado, pode levar a unha curación atrasada de feridas39. Este aumento é particularmente importante se os macrófagos son incapaces de transición dun fenotipo proinflamatorio a un fenotipo pro curado, dando lugar a que as feridas non saísen da fase inflamatoria de curación40. Observamos unha diminución dos neutrófilos e macrófagos en feridas infectadas por biofilm despois de 3 días de tratamento con todos os apósitos de prata, pero a diminución foi máis pronunciada con apósitos de sal osixenados. Esta diminución pode ser un resultado directo da resposta inmune á prata, unha resposta á diminución do bioburden ou á ferida nunha etapa posterior de curación e, polo tanto, as células inmunes na ferida reducidas. Reducir o número de células inflamatorias na ferida pode manter un ambiente propicio para a curación de feridas. O mecanismo de acción de como os oxisaltos de AG promoven a curación independente da infección non está claro, pero a capacidade dos oxisaltos de AG para producir osíxeno e destruír niveis nocivos de peróxido de hidróxeno, un mediador da inflamación, pode explicar isto e require máis estudo17.
As feridas infectadas crónicas non curativas supoñen un problema tanto para os médicos como para os pacientes. Aínda que moitos apósitos reclaman a eficacia antimicrobiana, a investigación raramente se centra noutros factores clave que inflúen no microambiente da ferida. Este estudo demostra que as diferentes tecnoloxías de prata teñen unha eficacia antimicrobiana diferentes e, polo que é importante, diferentes efectos sobre o ambiente da ferida e a curación, independentemente da infección. Aínda que estes estudos in vitro e in vivo mostran a eficacia destes apósitos para tratar as infeccións da ferida e promover a curación, son necesarios ensaios controlados aleatorios para avaliar a eficacia destes apósitos na clínica.
Os conxuntos de datos empregados e/ou analizados durante o estudo actual están dispoñibles do autor correspondente por solicitude razoable.
Tempo de publicación: xullo 15-2024