Heteroxeneidade das fibras musculares esqueléticas humanas máis alá da cadea pesada da miosina

Grazas por visitar nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses a versión máis recente do navegador (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, este sitio web estará libre de estilos nin de JavaScript.
O músculo esquelético é un tecido heteroxéneo composto predominantemente por miofibrilas, que nos humanos se clasifican normalmente en tres tipos: unha "lenta" (tipo 1) e dúas "rápidas" (tipos 2A e 2X). Non obstante, a heteroxeneidade entre e dentro dos tipos tradicionais de miofibrilas segue a ser pouco coñecida. Aplicamos enfoques transcriptómicos e proteómicos a 1050 e 1038 miofibrilas individuais do vasto lateral humano, respectivamente. O estudo proteómico incluíu homes e o estudo transcriptómico incluíu 10 homes e 2 mulleres. Ademais das isoformas da cadea pesada da miosina, identificamos proteínas metabólicas, proteínas ribosómicas e proteínas de unión celular como fontes de variabilidade intermiofibrilar multidimensional. Ademais, a pesar da identificación de grupos de fibras lentas e rápidas, os nosos datos suxiren que as fibras de tipo 2X son fenotipicamente indistinguibles doutras fibras de contracción rápida. Ademais, a clasificación baseada na cadea pesada da miosina é insuficiente para describir o fenotipo das miofibras nas miopatías nemalínicas. En xeral, os nosos datos suxiren unha heteroxeneidade multidimensional das miofibras, con fontes de variación que se estenden máis alá das isoformas da cadea pesada da miosina.
A heteroxeneidade celular é unha característica inherente a todos os sistemas biolóxicos, o que permite ás células especializarse para satisfacer as diferentes necesidades dos tecidos e as células.1 A visión tradicional da heteroxeneidade das fibras do músculo esquelético foi que as neuronas motoras definen o tipo de fibra dentro dunha unidade motora e que o tipo de fibra (é dicir, tipo 1, tipo 2A e tipo 2X en humanos) está determinado polas características das isoformas da cadea pesada da miosina (MYH).2 Isto baseouse inicialmente na súa inestabilidade da ATPase do pH,3,4 e máis tarde na súa expresión molecular de MYH.5 Non obstante, coa identificación e posterior aceptación de fibras "mixtas" que coexpresan múltiples MYH en proporcións variables, as fibras do músculo esquelético son vistas cada vez máis como un continuo en lugar de como tipos de fibra distintos.6 A pesar disto, o campo aínda depende en gran medida de MYH como o clasificador principal para a clasificación das miofibras, unha visión probablemente influenciada polas limitacións e os sesgos significativos dos primeiros estudos con roedores cuxos perfís de expresión de MYH e a gama de tipos de fibras difiren dos dos humanos.2 A situación complícase aínda máis polo feito de que os diferentes músculos esqueléticos humanos presentan unha gama diversa de tipos de fibras.7 O O vasto lateral é un músculo mixto cun perfil de expresión de MYH intermedio (e, polo tanto, representativo).7 Ademais, a súa facilidade de mostraxe convérteo no músculo mellor estudado en humanos.
Polo tanto, a investigación imparcial da diversidade das fibras musculares esqueléticas mediante potentes ferramentas "ómicas" é fundamental pero tamén desafiante, en parte debido á natureza multinucleada das fibras musculares esqueléticas. Non obstante, as tecnoloxías de transcriptómica8,9 e proteómica10 experimentaron unha revolución na sensibilidade nos últimos anos debido a diversos avances tecnolóxicos, o que permite a análise do músculo esquelético a unha resolución de fibra única. Como resultado, fixéronse progresos significativos na caracterización da diversidade de fibras únicas e a súa resposta a estímulos atróficos e ao envellecemento11,12,13,14,15,16,17,18. É importante destacar que estes avances tecnolóxicos teñen aplicacións clínicas, o que permite unha caracterización máis detallada e precisa da desregulación asociada a enfermidades. Por exemplo, a fisiopatoloxía da miopatía nemalínica, unha das enfermidades musculares hereditarias máis comúns (MIM 605355 e MIM 161800), é complexa e confusa.19,20 Polo tanto, unha mellor caracterización da desregulación das fibras musculares esqueléticas podería levar a avances significativos na nosa comprensión desta enfermidade.
Desenvolvemos métodos para a análise transcriptómica e proteómica de fibras musculares esqueléticas individuais illadas manualmente de mostras de biopsias humanas e aplicámolos a miles de fibras, o que nos permite investigar a heteroxeneidade celular das fibras musculares esqueléticas humanas. No transcurso deste traballo, demostramos o poder da fenotipificación transcriptómica e proteómica das fibras musculares e identificamos proteínas metabólicas, ribosómicas e de unión celular como fontes significativas de variabilidade interfibras. Ademais, utilizando este fluxo de traballo proteómico, caracterizamos a relevancia clínica da miopatía por nematodos en fibras musculares esqueléticas individuais, revelando un cambio coordinado cara a fibras non oxidativas independentes do tipo de fibra baseado na miopatía por nematodos.
Para investigar a heteroxeneidade das fibras musculares esqueléticas humanas, desenvolvemos dous fluxos de traballo para permitir a análise do transcriptoma e o proteoma de fibras musculares esqueléticas individuais (Figura 1A e Figura suplementaria 1A). Desenvolvemos e optimizamos varios pasos metodolóxicos, desde o almacenamento de mostras e a preservación da integridade do ARN e as proteínas ata a optimización do rendemento para cada enfoque. Para a análise do transcriptoma, isto conseguiuse inserindo códigos de barras moleculares específicos da mostra no paso inicial da transcrición inversa, o que permitiu agrupar 96 fibras para un procesamento posterior eficiente. Unha secuenciación máis profunda (±1 millón de lecturas por fibra) en comparación cos enfoques tradicionais de células individuais enriqueceu aínda máis os datos do transcriptoma.21 Para a proteómica, empregamos un gradiente cromatográfico curto (21 minutos) combinado coa adquisición de datos DIA-PASEF nun espectrómetro de masas timsTOF para optimizar a profundidade do proteoma mantendo un alto rendemento. 22,23 Para investigar a heteroxeneidade das fibras musculares esqueléticas sas, caracterizamos os transcriptomas de 1050 fibras individuais de 14 doantes adultos sas e os proteomas de 1038 fibras de 5 doantes adultos sas (Táboa suplementaria 1). Neste artigo, estes conxuntos de datos denomínanse transcriptomas e proteomas de 1000 fibras, respectivamente. A nosa estratexia detectou un total de 27237 transcritos e 2983 proteínas nas análises transcriptómicas e proteómicas de 1000 fibras (Figura 1A, conxuntos de datos suplementarios 1-2). Despois de filtrar os conxuntos de datos transcriptómicos e proteómicos para >1000 xenes detectados e un 50 % de valores válidos por fibra, realizáronse análises bioinformáticas posteriores para 925 e 974 fibras no transcriptoma e no proteoma, respectivamente. Tras o filtrado, detectouse unha media de 4257 ± 1557 xenes e 2015 ± 234 proteínas (media ± desviación estándar) por fibra, cunha variabilidade interindividual limitada (Figuras suplementarias 1B-C, Conxuntos de datos suplementarios 3-4). Non obstante, a variabilidade dentro dos suxeitos foi máis pronunciada entre os participantes, probablemente debido ás diferenzas no rendemento de ARN/proteína entre fibras de diferentes lonxitudes e áreas de sección transversal. Para a maioría das proteínas (>2000), o coeficiente de variación foi inferior ao 20 % (Figura suplementaria 1D). Ambos os métodos permitiron capturar unha ampla gama dinámica de transcritos e proteínas con sinaturas altamente expresadas importantes para a contracción muscular (por exemplo, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figuras suplementarias 1E-F). A maioría das características identificadas eran comúns entre os conxuntos de datos transcriptómicos e proteómicos (Figura suplementaria 1G), e as intensidades medias de UMI/LFQ destas características estaban razoablemente ben correlacionadas (r = 0,52) (Figura suplementaria 1H).
Fluxo de traballo de transcriptómica e proteómica (creado con BioRender.com). Curvas de rango dinámico de BD para MYH7, MYH2 e MYH1, e limiares calculados para a asignación do tipo de fibra. E, F Distribución da expresión de MYH entre fibras en conxuntos de datos de transcriptómica e proteómica. G, H Gráficos de Aproximación e Proxección de Diversidade Uniforme (UMAP) para transcriptómica e proteómica coloreados por tipo de fibra baseado en MYH. I, J Gráficos de características que mostran a expresión de MYH7, MYH2 e MYH1 en conxuntos de datos de transcriptómica e proteómica.
Inicialmente, propuxémonos asignar o tipo de fibra baseado en MYH a cada fibra empregando unha abordaxe optimizada que aproveita a alta sensibilidade e o rango dinámico da expresión de MYH nos conxuntos de datos ómica. Estudos previos empregaron limiares arbitrarios para etiquetar as fibras como tipo 1 puro, tipo 2A, tipo 2X ou mixtas baseándose nunha porcentaxe fixa de expresión de diferentes MYH11,14,24. Empregamos unha abordaxe diferente na que a expresión de cada fibra se clasificou segundo os MYH que empregamos para tipificar as fibras: MYH7, MYH2 e MYH1, correspondentes ás fibras de tipo 1, tipo 2A e tipo 2X, respectivamente. Despois, calculamos matematicamente o punto de inflexión inferior de cada curva resultante e usámolo como limiar para asignar as fibras como positivas (por riba do limiar) ou negativas (por debaixo do limiar) para cada MYH (Figura 1B-D). Estes datos demostran que MYH7 (Figura 1B) e MYH2 (Figura 1C) teñen perfís de expresión de activado/desactivado máis distintos a nivel de ARN en comparación co nivel de proteína. De feito, a nivel de proteínas, moi poucas fibras non expresaban MYH7 e ningunha fibra tiña unha expresión de MYH2 do 100 %. A continuación, empregamos limiares de expresión predeterminados para asignar tipos de fibras baseadas en MYH a todas as fibras de cada conxunto de datos. Por exemplo, as fibras MYH7+/MYH2-/MYH1- asignáronse ao tipo 1, mentres que as fibras MYH7-/MYH2+/MYH1+ asignáronse ao tipo mixto 2A/2X (véxase a Táboa suplementaria 2 para unha descrición completa). Ao agrupar todas as fibras, observamos unha distribución notablemente similar dos tipos de fibras baseadas en MYH tanto nos niveis de ARN (Figura 1E) como de proteínas (Figura 1F), mentres que a composición relativa dos tipos de fibras baseadas en MYH variaba entre os individuos, como se esperaba (Figura suplementaria 2A). A maioría das fibras clasificáronse como tipo 1 puro (34–35 %) ou tipo 2A (36–38 %), aínda que tamén se detectou un número significativo de fibras mixtas de tipo 2A/2X (16–19 %). Unha diferenza rechamante é que as fibras puras de tipo 2X só se puideron detectar a nivel de ARN, pero non a nivel de proteína, o que suxire que a expresión rápida de MYH está polo menos parcialmente regulada postranscricionalmente.
Validamos o noso método de tipificación de fibras MYH baseado na proteómica mediante dot blotting baseado en anticorpos, e ambos os métodos acadaron unha concordancia do 100 % na identificación de fibras puras de tipo 1 e tipo 2A (véxase a Figura suplementaria 2B). Non obstante, a abordaxe baseada na proteómica foi máis sensible e eficiente á hora de identificar fibras mixtas e cuantificar a proporción de cada xene MYH en cada fibra. Estes datos demostran a eficacia de usar unha abordaxe obxectiva e altamente sensible baseada na ómica para caracterizar os tipos de fibras musculares esqueléticas.
Despois empregamos a información combinada proporcionada pola transcriptómica e a proteómica para clasificar obxectivamente as miofibras en función do seu transcriptoma ou proteoma completo. Usando o método de aproximación e proxección de variedade uniforme (UMAP) para reducir a dimensionalidade a seis compoñentes principais (Figuras suplementarias 3A-B), puidemos visualizar a variabilidade das miofibras no transcriptoma (Figura 1G) e no proteoma (Figura 1H). Cabe destacar que as miofibras non se agruparon por participantes (Figuras suplementarias 3C-D) nin por días de proba (Figura suplementaria 3E) nos conxuntos de datos de transcriptómica nin de proteómica, o que suxire que a variabilidade dentro dun suxeito nas fibras musculares esqueléticas é maior que a variabilidade entre suxeitos. No gráfico UMAP, xurdiron dous grupos distintos que representan as miofibras "rápidas" e "lentas" (Figuras 1G-H). As miofibras MYH7+ (lentas) agrupáronse no polo positivo de UMAP1, mentres que as miofibras MYH2+ e MYH1+ (rápidas) agrupáronse no polo negativo de UMAP1 (Figuras 1I-J). Non obstante, non se fixo ningunha distinción entre os tipos de fibras de contracción rápida (é dicir, tipo 2A, tipo 2X ou mixtas 2A/2X) en función da expresión de MYH, o que suxire que a expresión de MYH1 (Figura 1I-J) ou outros marcadores clásicos de miofibras 2X como ACTN3 ou MYLK2 (Figuras suplementarias 4A-B) non diferencia entre os diferentes tipos de miofibras ao considerar o transcriptoma ou proteoma completo. Ademais, en comparación con MYH2 e MYH7, poucos transcritos ou proteínas correlacionáronse positivamente con MYH1 (Figuras suplementarias 4C-H), o que suxire que a abundancia de MYH1 non reflicte completamente o transcriptoma/proteoma das miofibras. Chegáronse conclusións semellantes ao avaliar a expresión mixta das tres isoformas de MYH a nivel de UMAP (figuras suplementarias 4I-J). Polo tanto, aínda que as fibras 2X poden identificarse a nivel de transcrición baseándose unicamente na cuantificación de MYH, as fibras MYH1+ non se distinguen doutras fibras rápidas ao considerar o transcriptoma ou proteoma completo.
Como exploración inicial da heteroxeneidade das fibras lentas máis alá de MYH, avaliamos catro proteínas establecidas específicas do tipo de fibra lenta: TPM3, TNNT1, MYL3 e ATP2A22. Os subtipos de fibras lentas mostraron correlacións de Pearson altas, aínda que non perfectas, con MYH7 tanto en transcriptómica (Figura suplementaria 5A) como en proteómica (Figura suplementaria 5B). Aproximadamente o 25 % e o 33 % das fibras lentas non foron clasificadas como fibras lentas puras por todos os subtipos de xenes/proteínas en transcriptómica (Figura suplementaria 5C) e proteómica (Figura suplementaria 5D), respectivamente. Polo tanto, a clasificación das fibras lentas baseada en múltiples subtipos de xenes/proteínas introduce unha complexidade adicional, mesmo para proteínas que se sabe que son específicas do tipo de fibra. Isto suxire que a clasificación das fibras baseada en isoformas dunha única familia de xenes/proteínas pode non reflectir adecuadamente a verdadeira heteroxeneidade das fibras musculares esqueléticas.
Para explorar máis a fondo a variabilidade fenotípica das fibras musculares esqueléticas humanas á escala do modelo ómico completo, realizamos unha redución da dimensionalidade imparcial dos datos mediante a análise de compoñentes principais (PCA) (Figura 2A). De xeito similar aos gráficos UMAP, nin o participante nin o día da proba influíron na agrupación de fibras a nivel de PCA (Figuras suplementarias 6A-C). En ambos conxuntos de datos, o tipo de fibra baseado en MYH explicouse mediante PC2, que mostrou un grupo de fibras de contracción lenta tipo 1 e un segundo grupo que contiña fibras de contracción rápida tipo 2A, tipo 2X e fibras mixtas 2A/2X (Figura 2A). En ambos conxuntos de datos, estes dous grupos estaban conectados por un pequeno número de fibras mixtas tipo 1/2A. Como se esperaba, a análise de sobrerrepresentación dos principais impulsores de PC confirmou que a PC2 estaba impulsada por sinaturas contráctiles e metabólicas (Figura 2B e Figuras suplementarias 6D-E, Conxuntos de datos suplementarios 5-6). En xeral, descubriuse que o tipo de fibra baseado en MYH era suficiente para explicar a variación continua ao longo de PC2, coa excepción das chamadas fibras 2X que se distribuían por todo o transcriptoma dentro do clúster rápido.
A. Gráficos de análise de compoñentes principais (PCA) de conxuntos de datos de transcriptomas e proteomas coloreados segundo o tipo de fibra baseado en MYH. B. Análise de enriquecemento de controladores de transcritos e proteínas en PC2 e PC1. A análise estatística realizouse usando o paquete clusterProfiler e valores p axustados por Benjamini-Hochberg. C, D. Gráficos de PCA coloreados segundo os termos da ontoloxía xénica da adhesión intercelular (GO) no transcriptoma e os termos GO dos costámeros no proteoma. As frechas representan os controladores de transcritos e proteínas e as súas direccións. E, F. Gráficos de aproximación e proxección de variedades uniformes (UMAP) de características clinicamente relevantes que mostran gradientes de expresión independentes do tipo de fibra lenta/rápida. G, H. Correlacións entre os controladores PC2 e PC1 en transcriptomas e proteomas.
Inesperadamente, o tipo de miofibra baseado en MYH explicou só o segundo grao máis alto de variabilidade (PC2), o que suxire que outros factores biolóxicos non relacionados co tipo de miofibra baseado en MYH (PC1) desempeñan un papel importante na regulación da heteroxeneidade das fibras musculares esqueléticas. A análise de sobrerrepresentación dos principais impulsores en PC1 revelou que a variabilidade en PC1 estaba determinada principalmente pola adhesión célula-célula e o contido de ribosomas no transcriptoma, e polos costámeros e as proteínas ribosómicas no proteoma (Figura 2B e Figuras Suplementarias 6D-E, Conxunto de Datos Suplementario 7). No músculo esquelético, os costámeros conectan o disco Z co sarcolema e están implicados na transmisión e sinalización da forza. 25 Os gráficos PCA anotados que usan características de adhesión célula-célula (transcriptoma, Figura 2C) e costámeros (proteoma, Figura 2D) revelaron un forte desprazamento á esquerda en PC1, o que indica que estas características están enriquecidas en certas fibras.
Un exame máis detallado da agrupación de miofibras a nivel UMAP revelou que a maioría das características exhibiron un gradiente de expresión baseado en MYH independente do tipo de miofibra en lugar dun subgrupo de miofibras específico. Esta continuidade observouse para varios xenes asociados con condicións patolóxicas (Figura 2E), como CHCHD10 (enfermidade neuromuscular), SLIT3 (atrofia muscular) e CTDNEP1 (enfermidade muscular). Esta continuidade tamén se observou en todo o proteoma, incluíndo proteínas asociadas con trastornos neurolóxicos (UGDH), sinalización da insulina (PHIP) e transcrición (HIST1H2AB) (Figura 2F). Conxuntamente, estes datos indican continuidade na heteroxeneidade da contracción lenta/rápida independente do tipo de fibra en diferentes miofibras.
Curiosamente, os xenes impulsores en PC2 mostraron unha boa correlación transcriptoma-proteoma (r = 0,663) (Figura 2G), o que suxire que os tipos de fibras de contracción lenta e rápida, e en particular as propiedades contráctiles e metabólicas das fibras musculares esqueléticas, están reguladas transcricionalmente. Non obstante, os xenes impulsores en PC1 non mostraron correlación transcriptoma-proteoma (r = -0,027) (Figura 2H), o que suxire que as variacións non relacionadas cos tipos de fibras de contracción lenta/rápida están reguladas en gran medida postranscricionalmente. Dado que as variacións en PC1 se explicaban principalmente por termos de ontoloxía xénica ribosómica, e dado que os ribosomas desempeñan un papel crucial e especializado na célula ao participar activamente e influír na tradución de proteínas,31 a continuación propuxémonos investigar esta heteroxeneidade ribosómica inesperada.
Primeiro coloreamos o gráfico da análise de compoñentes principais da proteómica segundo a abundancia relativa de proteínas no termo GOCC "ribosoma citoplasmático" (Figura 3A). Aínda que este termo está enriquecido no lado positivo de PC1, o que resulta nun pequeno gradiente, as proteínas ribosómicas impulsan a partición en ambas direccións de PC1 (Figura 3A). As proteínas ribosómicas enriquecidas no lado negativo de PC1 incluían RPL18, RPS18 e RPS13 (Figura 3B), mentres que RPL31, RPL35 e RPL38 (Figura 3C) foron as principais impulsoras no lado positivo de PC1. Curiosamente, RPL38 e RPS13 expresáronse en gran medida no músculo esquelético en comparación con outros tecidos (Figura suplementaria 7A). Estas sinaturas ribosómicas distintivas en PC1 non se observaron no transcriptoma (Figura suplementaria 7B), o que indica regulación postranscricional.
A. Gráfico de análise de compoñentes principais (PCA) coloreado segundo os termos da ontoloxía xénica ribosómica (GO) citoplasmática a través do proteoma. As frechas indican a dirección da variación mediada por proteínas no gráfico PCA. A lonxitude da liña corresponde á puntuación do compoñente principal para unha proteína determinada. B, C. Gráficos de características PCA para RPS13 e RPL38. D. Análise de agrupamento xerárquico non supervisado de proteínas ribosómicas citoplasmáticas. E. Modelo estrutural do ribosoma 80S (PDB: 4V6X) que destaca as proteínas ribosómicas con diferentes abundancias nas fibras musculares esqueléticas. F. Proteínas ribosómicas con diferente estequiometría localizadas preto do canal de saída do ARNm.
Os conceptos de heteroxeneidade e especialización ribosómica xa foron propostos previamente, segundo os cales a presenza de distintas subpoboacións de ribosomas (heteroxeneidade ribosómica) pode influír directamente na tradución de proteínas en diferentes tecidos32 e células33 a través da tradución selectiva de conxuntos de transcritos de ARNm específicos34 (especialización ribosómica). Para identificar subpoboacións de proteínas ribosómicas coexpresadas nas fibras musculares esqueléticas, realizamos unha análise de agrupamento xerárquico non supervisado de proteínas ribosómicas no proteoma (Figura 3D, conxunto de datos suplementarios 8). Como era de esperar, as proteínas ribosómicas non se agruparon por tipo de fibra baseándose en MYH. Non obstante, identificamos tres grupos distintos de proteínas ribosómicas; o primeiro grupo (grupo_ribosómico_1) está corregulado con RPL38 e, polo tanto, ten unha maior expresión en fibras cun perfil de PC1 positivo. O segundo grupo (grupo_ribosómico_2) está corregulado con RPS13 e está elevado en fibras cun perfil de PC1 negativo. O terceiro clúster (clúster_ribosómico_3) non mostra unha expresión diferencial coordinada nas fibras musculares esqueléticas e pódese considerar a proteína ribosómica "central" do músculo esquelético. Tanto os clústeres ribosómicos 1 como 2 conteñen proteínas ribosómicas que se demostrou previamente que regulan a tradución alternativa (por exemplo, RPL10A, RPL38, RPS19 e RPS25) e inflúen funcionalmente no desenvolvemento (por exemplo, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 En consonancia cos resultados da PCA, a representación heteroxénea observada destas proteínas ribosómicas nas fibras tamén mostrou continuidade (Figura suplementaria 7C).
Para visualizar a localización das proteínas ribosómicas heteroxéneas dentro do ribosoma, empregamos un modelo estrutural do ribosoma 80S humano (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Despois de illar as proteínas ribosómicas pertencentes a diferentes grupos ribosómicos, as súas localizacións non estaban estreitamente aliñadas, o que suxire que o noso enfoque non conseguiu proporcionar enriquecemento para certas rexións/fraccións do ribosoma. Non obstante, é interesante que a proporción de proteínas de subunidades grandes no grupo 2 fose menor que nos grupos 1 e 3 (Figura suplementaria 7D). Observamos que as proteínas con estequiometría alterada nas fibras musculares esqueléticas estaban localizadas predominantemente na superficie do ribosoma (Figura 3E), o que é consistente coa súa capacidade para interactuar con elementos internos do sitio de entrada do ribosoma (IRES) en diferentes poboacións de ARNm, coordinando así a tradución selectiva. 40, 41 Ademais, moitas proteínas con estequiometría alterada nas fibras musculares esqueléticas estaban localizadas preto de rexións funcionais como o túnel de saída do ARNm (Figura 3F), que regulan selectivamente o alongamento translacional e a detención de péptidos específicos. 42 En resumo, os nosos datos suxiren que a estequiometría das proteínas ribosómicas do músculo esquelético presenta heteroxeneidade, o que resulta en diferenzas entre as fibras do músculo esquelético.
A continuación, propuxémonos identificar as sinaturas de fibras de contracción rápida e lenta e explorar os mecanismos da súa regulación transcricional. Ao comparar os grupos de fibras de contracción rápida e lenta definidos por UMAP nos dous conxuntos de datos (Figuras 1G-H e 4A-B), as análises transcriptómicas e proteómicas identificaron 1366 e 804 características diferencialmente abundantes, respectivamente (Figuras 4A-B, Conxuntos de datos suplementarios 9-12). Observamos as diferenzas esperadas nas sinaturas relacionadas cos sarcómeros (por exemplo, tropomiosina e troponina), o acoplamento excitación-contracción (isoformas SERCA) e o metabolismo enerxético (por exemplo, ALDOA e CKB). Ademais, os transcritos e as proteínas que regulan a ubiquitinación de proteínas expresáronse diferencialmente nas fibras de contracción rápida e lenta (por exemplo, USP54, SH3RF2, USP28 e USP48) (Figuras 4A-B). Ademais, o xene da proteína microbiana RP11-451G4.2 (DWORF), que xa se demostrou previamente que se expresa diferencialmente en todos os tipos de fibras musculares de cordeiro43 e potencia a actividade SERCA no músculo cardíaco44, estaba significativamente regulado positivamente nas fibras musculares esqueléticas lentas (Figura 4A). Do mesmo xeito, a nivel de fibra individual, observáronse diferenzas significativas en sinaturas coñecidas como as isoformas da lactato deshidroxenase relacionadas co metabolismo (LDHA e LDHB, Figura 4C e Figura Suplementaria 8A)45,46, así como sinaturas específicas do tipo de fibra previamente descoñecidas (como IRX3, USP54, USP28 e DPYSL3) (Figura 4C). Houbo unha superposición significativa de características expresadas diferencialmente entre os conxuntos de datos transcriptómicos e proteómicos (Figura Suplementaria 8B), así como unha correlación de cambio de pregamento impulsada principalmente pola expresión diferencial máis pronunciada das características do sarcómero (Figura Suplementaria 8C). Cabe destacar que algunhas sinaturas (por exemplo, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) mostraron unha forte regulación postranscricional só a nivel proteómico e tiveron perfís de expresión específicos do tipo de fibra de contracción lenta/rápida (Figura suplementaria 8C).
Gráficos de volcáns A e B que comparan clústeres lentos e rápidos identificados polos gráficos de aproximación e proxección de variedade uniforme (UMAP) nas figuras 1G–H. Os puntos de cores representan transcritos ou proteínas que son significativamente diferentes a FDR < 0,05, e os puntos máis escuros representan transcritos ou proteínas que son significativamente diferentes a cambio logarítmico > 1. A análise estatística bidireccional realizouse usando a proba de Wald DESeq2 con valores p axustados por Benjamini-Hochberg (transcriptómica) ou o método do modelo lineal de Limma con análise bayesiana empírica seguida de axuste de Benjamini-Hochberg para comparacións múltiples (proteómica). C Gráficos de sinatura de xenes ou proteínas expresados ​​diferencialmente seleccionados entre fibras lentas e rápidas. D Análise de enriquecemento de transcritos e proteínas expresadas diferencialmente significativamente. Os valores superpostos están enriquécidos en ambos conxuntos de datos, os valores do transcritoma están enriquécidos só no transcritoma e os valores do proteoma están enriquécidos só no proteoma. A análise estatística realizouse usando o paquete clusterProfiler con valores p axustados por Benjamini-Hochberg. E. Factores de transcrición específicos do tipo de fibra identificados por SCENIC baseándose en puntuacións de especificidade reguladora derivadas de SCENIC e expresión diferencial de ARNm entre tipos de fibra. F. Elaboración de perfís de factores de transcrición seleccionados expresados ​​diferencialmente entre fibras lentas e rápidas.
A continuación, realizamos unha análise de sobrerrepresentación de xenes e proteínas representados diferencialmente (Figura 4D, Conxunto de datos suplementarios 13). O enriquecemento de rutas para características que diferían entre os dous conxuntos de datos revelou diferenzas esperadas, como os procesos de β-oxidación de ácidos graxos e metabolismo de cetonas (fibras lentas), contracción de miofilamentos/musculares (fibras rápidas e lentas, respectivamente) e procesos catabólicos de carbohidratos (fibras rápidas). A actividade da proteína fosfatase de serina/treonina tamén se elevou nas fibras rápidas, impulsada por características como as subunidades reguladoras e catalíticas da fosfatase (PPP3CB, PPP1R3D e PPP1R3A), que se sabe que regulan o metabolismo do glicóxeno (47) (Figuras suplementarias 8D-E). Outras vías enriquecidas en fibras rápidas incluíron corpos de procesamento (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) no proteoma (Figura suplementaria 8F), potencialmente implicados na regulación postranscricional (48), e actividade de factores de transcrición (SREBF1, RXRG, RORA) no transcriptoma (Figura suplementaria 8G). As fibras lentas enriquecéronse en actividade de oxidorredutase (BDH1, DCXR, TXN2) (Figura suplementaria 8H), unión a amidas (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figura suplementaria 8I), matriz extracelular (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figura suplementaria 8J) e actividade de ligando receptor (FNDC5, SPX, NENF) (Figura suplementaria 8K).
Para obter máis información sobre a regulación transcricional subxacente ás características dos tipos de fibras musculares lentas/rápidas, realizamos unha análise de enriquecemento de factores de transcrición empregando SCENIC49 (conxunto de datos suplementarios 14). Moitos factores de transcrición enriquecéronse significativamente entre as fibras musculares rápidas e lentas (Figura 4E). Isto incluíu factores de transcrición como MAFA, que se relacionou previamente co desenvolvemento rápido das fibras musculares,50 así como varios factores de transcrición que non se asociaron previamente con programas xénicos específicos do tipo de fibra muscular. Entre estes, PITX1, EGR1 e MYF6 foron os factores de transcrición máis enriquecidos nas fibras musculares rápidas (Figura 4E). En contraste, ZSCAN30 e EPAS1 (tamén coñecido como HIF2A) foron os factores de transcrición máis enriquecidos nas fibras musculares lentas (Figura 4E). En consonancia con isto, MAFA expresouse a niveis máis altos na rexión UMAP correspondente ás fibras musculares rápidas, mentres que EPAS1 tiña o patrón de expresión oposto (Figura 4F).
Ademais dos xenes codificantes de proteínas coñecidos, existen numerosos biotipos de ARN non codificantes que poden estar implicados na regulación do desenvolvemento e as enfermidades humanas. 51, 52 Nos conxuntos de datos do transcriptoma, varios ARN non codificantes presentan especificidade de tipo de fibra (Figura 5A e conxunto de datos suplementario 15), incluído o LINC01405, que é moi específico para as fibras lentas e segundo se informa está diminuído no músculo de pacientes con miopatía mitocondrial. 53 En contraste, o RP11-255P5.3, correspondente ao xene lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, presenta especificidade de tipo de fibra rápida. Tanto LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) como RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) presentan especificidade do músculo esquelético (Figuras suplementarias 9A–B) e non teñen xenes contráctiles coñecidos dentro da súa veciñanza xenómica de 1 Mb, o que suxire que desempeñan un papel especializado na regulación dos tipos de fibras en lugar de na regulación dos xenes contráctiles veciños. Os perfís de expresión específicos do tipo de fibra lenta/rápida de LINC01405 e RP11-255P5.3, respectivamente, confirmáronse mediante RNAscope (Figuras 5B–C).
A. Os transcritos de ARN non codificante están regulados significativamente nas fibras musculares de contracción lenta e rápida. B. Imaxes representativas de RNAscope que mostran a especificidade do tipo de fibra de contracción lenta e rápida de LINC01405 e RP11-255P5.3, respectivamente. Barra de escala = 50 μm. C. Cuantificación da expresión de ARN non codificante específica do tipo de miofibra determinada por RNAscope (n = 3 biopsias de individuos independentes, comparando as fibras musculares rápidas e lentas dentro de cada individuo). A análise estatística realizouse mediante unha proba t de Student bilateral. Os diagramas de caixa mostran a mediana e o primeiro e terceiro cuartís, cos bigotes apuntando aos valores mínimo e máximo. D. Fluxo de traballo de identificación de proteínas microbianas de novo (creado con BioRender.com). E. A proteína microbiana LINC01405_ORF408:17441:17358 exprésase especificamente nas fibras musculares esqueléticas lentas (n = 5 biopsias de participantes independentes, comparando as fibras musculares rápidas e lentas en cada participante). A análise estatística realizouse empregando o método do modelo lineal de Limm combinado cunha abordaxe bayesiana empírica, seguido do método de Benjamini-Hochberg para comparacións múltiples con axuste do valor p. Os diagramas de caixa mostran a mediana, o primeiro e o terceiro cuartil, cos bigotes apuntando aos valores máximos/mínimos.
Recentemente, estudos demostraron que moitos supostos transcritos non codificantes codifican proteínas microbianas transcriptas, algunhas das cales regulan a función muscular.44, 55 Para identificar proteínas microbianas con posible especificidade de tipo de fibra, buscamos no noso conxunto de datos de proteomas de 1000 fibras usando un ficheiro FASTA personalizado que contiña as secuencias de transcritos non codificantes (n = 305) atopadas no conxunto de datos de transcritomas de 1000 fibras (Figura 5D). Identificamos 197 proteínas microbianas de 22 transcritos diferentes, 71 dos cales estaban regulados diferencialmente entre as fibras musculares esqueléticas lentas e rápidas (Figura suplementaria 9C e Conxunto de datos suplementario 16). Para LINC01405, identificáronse tres produtos proteicos microbianos, un dos cales mostrou unha especificidade de fibra lenta similar á súa transcrición (Figura 5E e Figura suplementaria 9D). Polo tanto, identificamos LINC01405 como un xene que codifica unha proteína microbiana específica para as fibras musculares esqueléticas lentas.
Desenvolvemos un fluxo de traballo completo para a caracterización proteómica a grande escala de fibras musculares individuais e identificamos reguladores da heteroxeneidade das fibras en estados sans. Aplicamos este fluxo de traballo para comprender como as miopatías nemalínicas afectan á heteroxeneidade das fibras musculares esqueléticas. As miopatías nemalínicas son enfermidades musculares hereditarias que causan debilidade muscular e, nos nenos afectados, presentan unha serie de complicacións, como dificultade respiratoria, escoliose e mobilidade limitada das extremidades. 19,20 Normalmente, nas miopatías nemalínicas, as variantes patóxenas en xenes como a actina alfa 1 (ACTA1) resultan nun predominio da composición de miofibras de fibras de contracción lenta, aínda que este efecto é heteroxéneo. Unha excepción notable é a miopatía nemalínica por troponina T1 (TNNT1), que ten un predominio de fibras rápidas. Polo tanto, unha mellor comprensión da heteroxeneidade subxacente á desregulación das fibras musculares esqueléticas observada nas miopatías nemalínicas pode axudar a desentrañar a complexa relación entre estas enfermidades e o tipo de miofibra.
En comparación cos controis sans (n=3 por grupo), as miofibras illadas de pacientes con miopatía nemalínica con mutacións nos xenes ACTA1 e TNNT1 mostraron unha marcada atrofia ou distrofia das miofibras (Figura 6A, Táboa suplementaria 3). Isto presentou importantes desafíos técnicos para a análise proteómica debido á cantidade limitada de material dispoñible. A pesar disto, puidemos detectar 2485 proteínas en 272 miofibras esqueléticas. Despois de filtrar polo menos 1000 proteínas cuantificadas por fibra, 250 fibras foron sometidas a unha posterior análise bioinformática. Despois do filtrado, cuantificouse unha media de 1573 ± 359 proteínas por fibra (Figura suplementaria 10A, Conxuntos de datos suplementarios 17-18). Cabe destacar que, a pesar da redución significativa no tamaño das fibras, a profundidade do proteoma das mostras de pacientes con miopatía nemalínica só se reduciu modestamente. Ademais, o procesamento destes datos empregando os nosos propios ficheiros FASTA (incluíndo transcritos non codificantes) permitiunos identificar cinco proteínas microbianas en miofibras esqueléticas de pacientes con miopatía nemalínica (conxunto de datos suplementario 19). O rango dinámico do proteoma foi significativamente máis amplo e as proteínas totais no grupo de control correlacionáronse ben cos resultados dunha análise previa do proteoma de 1000 fibras (figura suplementaria 10B-C).
A. Imaxes microscópicas que mostran atrofia ou distrofia das fibras e a predominancia de diferentes tipos de fibras baseadas en MYH en miopatías nemalínicas (NM) ACTA1 e TNNT1. Barra de escala = 100 μm. Para garantir a reproducibilidade da tinción en pacientes con ACTA1 e TNNT1, tinguíronse tres biopsias de pacientes de dúas a tres veces (catro seccións por caso) antes de seleccionar imaxes representativas. B. Proporcións do tipo de fibra nos participantes baseadas en MYH. C. Gráfico de análise de compoñentes principais (PCA) das fibras musculares esqueléticas en pacientes con miopatías nemalínicas e controis. D. Fibras musculares esqueléticas de pacientes con miopatías nemalínicas e controis proxectadas nun gráfico PCA determinado a partir das 1000 fibras analizadas na Figura 2. Por exemplo, gráficos de volcán que comparan as diferenzas entre participantes con miopatías nemalínicas ACTA1 e TNNT1 e controis, e entre participantes con miopatías nemalínicas ACTA1 e TNNT1. Os círculos de cores indican as proteínas que eran significativamente diferentes a π < 0,05 e os puntos escuros indican as proteínas que eran significativamente diferentes a FDR < 0,05. A análise estatística realizouse mediante o método do modelo lineal de Limma e métodos bayesianos empíricos, seguido dun axuste do valor p para comparacións múltiples mediante o método de Benjamini-Hochberg. H. Análise de enriquecemento de proteínas expresadas diferencialmente de forma significativa en todo o proteoma e en fibras de tipo 1 e 2A. A análise estatística realizouse mediante o paquete clusterProfiler e valores p axustados por Benjamini-Hochberg. I, J. Gráficos de análise de compoñentes principais (PCA) coloreados por termos da matriz extracelular e da ontoloxía xénica mitocondrial (GO).
Dado que as miopatías nemalínicas poden influír na proporción de tipos de miofibras que expresan MYH no músculo esquelético,19,20 primeiro examinamos os tipos de miofibras que expresan MYH en pacientes con miopatías nemalínicas e controis. Determinamos o tipo de miofibra empregando un método imparcial descrito previamente para o ensaio de 1000 miofibras (figuras suplementarias 10D-E) e, de novo, non conseguimos identificar miofibras 2X puras (Figura 6B). Observamos un efecto heteroxéneo das miopatías nemalínicas no tipo de miofibras, xa que dous pacientes con mutacións ACTA1 tiñan unha maior proporción de miofibras de tipo 1, mentres que dous pacientes con miopatía nemalínica TNNT1 tiñan unha menor proporción de miofibras de tipo 1 (Figura 6B). De feito, a expresión das isoformas de MYH2 e da troponina rápida (TNNC2, TNNI2 e TNNT3) diminuíu nas miopatías por ACTA1-nemalina, mentres que a expresión de MYH7 diminuíu nas miopatías por TNNT1-nemalina (Figura suplementaria 11A). Isto é consistente con informes previos de cambio heteroxéneo de tipo de miofibras en miopatías nemalínicas.19,20 Confirmamos estes resultados mediante inmunohistoquímica e descubrimos que os pacientes con miopatía por ACTA1-nemalina tiñan unha predominancia de miofibras de tipo 1, mentres que os pacientes con miopatía por TNNT1-nemalina tiñan o patrón oposto (Figura 6A).
A nivel do proteoma dunha soa fibra, as fibras musculares esqueléticas dos pacientes con miopatía nemalínica ACTA1 e TNNT1 agrupáronse coa maioría das fibras de control, sendo as fibras con miopatía nemalínica TNNT1 xeralmente as máis afectadas (Figura 6C). Isto foi particularmente evidente ao trazar gráficos de análise de compoñentes principais (PCA) de fibras pseudoinfladas para cada paciente, cos pacientes 2 e 3 con miopatía nemalínica TNNT1 aparecendo os máis distantes das mostras de control (Figura suplementaria 11B, Conxunto de datos suplementario 20). Para comprender mellor como se comparan as fibras dos pacientes con miopatía coas fibras sas, empregamos información detallada obtida da análise proteómica de 1000 fibras de participantes adultos sas. Proxectamos fibras do conxunto de datos de miopatía (pacientes e controis con miopatía nemalínica ACTA1 e TNNT1) no gráfico PCA obtido da análise proteómica de 1000 fibras (Figura 6D). A distribución dos tipos de fibras MYH ao longo de PC2 nas fibras de control foi similar á distribución de fibras obtida da análise proteómica de 1000 fibras. Non obstante, a maioría das fibras nos pacientes con miopatía nemalínica desprazáronse cara a PC2, solapándose con fibras sas de contracción rápida, independentemente do seu tipo de fibra MYH nativa. Así, aínda que os pacientes con miopatía nemalínica ACTA1 mostraron un desprazamento cara ás fibras de tipo 1 cando se cuantificaron mediante métodos baseados en MYH, tanto a miopatía nemalínica ACTA1 como a miopatía nemalínica TNNT1 desprazaron o proteoma da fibra muscular esquelética cara ás fibras de contracción rápida.
Despois comparamos directamente cada grupo de pacientes con controis sans e identificamos 256 e 552 proteínas expresadas diferencialmente nas miopatías nemalínicas ACTA1 e TNNT1, respectivamente (Figura 6E-G e Figura Suplementaria 11C, Conxunto de Datos Suplementario 21). A análise de enriquecemento xénico revelou unha diminución coordinada nas proteínas mitocondriais (Figura 6H-I, Conxunto de Datos Suplementario 22). Sorprendentemente, a pesar da predominancia diferencial dos tipos de fibras nas miopatías nemalínicas ACTA1 e TNNT1, esta diminución foi completamente independente do tipo de fibra baseada en MYH (Figura 6H e Figuras Suplementarias 11D-I, Conxunto de Datos Suplementario 23). Tres proteínas microbianas tamén estaban reguladas nas miopatías nemalínicas ACTA1 ou TNNT1. Dúas destas microproteínas, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (tamén coñecida como LINC00598 ou Lnc-FOXO1) e ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), mostraron unha abundancia diferencial só nas miofibras de tipo 1. Xa se informou previamente de que ENSG00000215483_TR14_ORF67 desempeña un papel na regulación do ciclo celular. 56 Por outra banda, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (correspondente a LINC01798) aumentou tanto nas miofibras de tipo 1 como de tipo 2A na miopatía nemalínica ACTA1 en comparación cos controis sans (Figura suplementaria 12A, Conxunto de datos suplementario 24). En contraste, as proteínas ribosómicas non se viron afectadas en gran medida pola miopatía nemalínica, aínda que a RPS17 estaba regulada á baixa na miopatía nemalínica ACTA1 (Fig. 6E).
A análise de enriquecemento tamén revelou unha regulación á alza dos procesos do sistema inmunitario nas miopatías nemalínicas ACTA1 e TNNT1, mentres que a adhesión celular tamén aumentou na miopatía nemalínica TNNT1 (Figura 6H). O enriquecemento destes factores extracelulares reflectiuse no desprazamento das proteínas da matriz extracelular de PCA en PC1 e PC2 nunha dirección negativa (é dicir, cara ás fibras máis afectadas) (Figura 6J). Ambos os grupos de pacientes mostraron unha maior expresión de proteínas extracelulares implicadas nas respostas inmunitarias e nos mecanismos de reparación sarcolemal, como as anexinas (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 e a súa proteína interactiva S100A1159 (Figuras suplementarias 12B-C). Xa se informou previamente que este proceso se ve mellorado nas distrofias musculares60 pero, segundo o noso coñecemento, non se asociou previamente con miopatías nemalínicas. A función normal desta maquinaria molecular é necesaria para a reparación sarcolemal despois dunha lesión e para a fusión de miocitos recentemente formados con miofibras58,61. Polo tanto, o aumento da actividade deste proceso en ambos os grupos de pacientes suxire unha resposta reparadora ás lesións causadas pola inestabilidade das miofibras.
Os efectos de cada miopatía nemalínica estiveron ben correlacionados (r = 0,736) e mostraron unha superposición razoable (Figuras suplementarias 11A-B), o que indica que a miopatía nemalínica ACTA1 e TNNT1 teñen efectos similares no proteoma. Non obstante, algunhas proteínas só estaban reguladas na miopatía nemalínica ACTA1 ou TNNT1 (Figuras suplementarias 11A e C). A proteína profibrótica MFAP4 foi unha das proteínas máis reguladas ao alza na miopatía nemalínica TNNT1, pero permaneceu sen cambios na miopatía nemalínica ACTA1. SKIC8, un compoñente do complexo PAF1C responsable da regulación da transcrición do xene HOX, estaba regulado á baixa na miopatía nemalínica TNNT1, pero non se viu afectado na miopatía nemalínica ACTA1 (Figura suplementaria 11A). A comparación directa da miopatía nemalínica por ACTA1 e TNNT1 revelou maiores reducións nas proteínas mitocondriais e aumentos nas proteínas do sistema inmunitario na miopatía nemalínica por TNNT1 (Figura 6G-H e Figuras suplementarias 11C e 11H-I). Estes datos son consistentes coa maior atrofia/distrofia observada na miopatía nemalínica por TNNT1 en comparación coa miopatía nemalínica por TNNT1 (Figura 6A), o que suxire que a miopatía nemalínica por TNNT1 representa unha forma máis grave da enfermidade.
Para avaliar se os efectos observados da miopatía nemalínica persisten a nivel de todo o músculo, realizamos unha análise proteómica a granel de biopsias musculares da mesma cohorte de pacientes con miopatía nemalínica TNNT1 e comparámolos cos controis (n = 3 por grupo) (Fig. suplementaria 13A, conxunto de datos suplementarios 25). Como era de esperar, os controis estaban estreitamente relacionados na análise de compoñentes principais, mentres que os pacientes con miopatía nemalínica TNNT1 mostraron unha maior variabilidade entre mostras similar á observada na análise de fibra única (Fig. suplementaria 13B). A análise a granel reproduciu as proteínas expresadas diferencialmente (Fig. suplementaria 13C, conxunto de datos suplementarios 26) e os procesos biolóxicos (Fig. suplementaria 13D, conxunto de datos suplementarios 27) destacados ao comparar fibras individuais, pero perdeu a capacidade de distinguir entre diferentes tipos de fibras e non conseguiu ter en conta os efectos heteroxéneos da enfermidade entre as fibras.
En conxunto, estes datos demostran que a proteómica dunha soa miofibra pode dilucidar características biolóxicas clínicas que non son detectables por métodos dirixidos como a inmunotransferencia. Ademais, estes datos salientan as limitacións do uso único da tipificación das fibras de actina (MYH) para describir a adaptación fenotípica. De feito, aínda que o cambio de tipo de fibra difire entre as miopatías nemalínicas de actina e troponina, ambas as miopatías nemalínicas desacoplan a tipificación das fibras MYH do metabolismo das fibras musculares esqueléticas cara a un proteoma muscular máis rápido e menos oxidativo.
A heteroxeneidade celular é fundamental para que os tecidos satisfagan as súas diversas demandas. No músculo esquelético, isto adoita describirse como tipos de fibras caracterizados por diferentes graos de produción de forza e fatigabilidade. Non obstante, está claro que isto explica só unha pequena parte da variabilidade das fibras do músculo esquelético, que é moito máis variable, complexa e multifacética do que se pensaba anteriormente. Os avances tecnolóxicos agora arroxaron luz sobre os factores que regulan as fibras do músculo esquelético. De feito, os nosos datos suxiren que as fibras de tipo 2X poden non ser un subtipo distinto de fibra do músculo esquelético. Ademais, identificamos proteínas metabólicas, proteínas ribosómicas e proteínas asociadas a células como os principais determinantes da heteroxeneidade das fibras do músculo esquelético. Ao aplicar o noso fluxo de traballo proteómico a mostras de pacientes con miopatía por nematodos, demostramos ademais que a tipificación de fibras baseada en MYH non reflicte plenamente a heteroxeneidade do músculo esquelético, especialmente cando o sistema está perturbado. De feito, independentemente do tipo de fibra baseada en MYH, a miopatía por nematodos provoca un cambio cara a fibras máis rápidas e menos oxidativas.
As fibras musculares esqueléticas clasificáronse desde o século XIX. As análises ómicas recentes permitíronnos comezar a comprender os perfís de expresión de diferentes tipos de fibras MYH e as súas respostas a diferentes estímulos. Como se describe aquí, as abordaxes ómicas tamén teñen a vantaxe dunha maior sensibilidade para cuantificar marcadores de tipo de fibra que os métodos tradicionais baseados en anticorpos, sen depender da cuantificación dun só (ou uns poucos) marcadores para definir un tipo de fibra muscular esquelética. Empregamos fluxos de traballo transcriptómicos e proteómicos complementarios e integramos os resultados para examinar a regulación transcricional e postranscricional da heteroxeneidade das fibras nas fibras musculares esqueléticas humanas. Este fluxo de traballo provocou que non se identificasen fibras puras de tipo 2X a nivel de proteína no vasto lateral da nosa cohorte de homes novos sans. Isto é consistente con estudos previos de fibra única que atoparon <1 % de fibras 2X puras en vasto lateral sans, aínda que isto debería confirmarse noutros músculos no futuro. A discrepancia entre a detección de fibras 2X case puras a nivel de ARNm e só fibras 2A/2X mesturadas a nivel de proteína é desconcertante. A expresión do ARNm da isoforma MYH non é circadiana, o que suxire que é improbable que “perdésemos” o sinal de inicio de MYH2 en fibras 2X aparentemente puras a nivel de ARN. Unha posible explicación, aínda que puramente hipotética, poderían ser as diferenzas na estabilidade das proteínas e/ou do ARNm entre as isoformas de MYH. De feito, ningunha fibra rápida é 100 % pura para ningunha isoforma de MYH, e non está claro se os niveis de expresión do ARNm de MYH1 no rango do 70–90 % darían lugar a unha abundancia igual de MYH1 e MYH2 a nivel de proteína. Non obstante, ao considerar o transcriptoma ou proteoma completo, a análise de clústeres pode identificar con confianza só dous clústeres distintos que representan as fibras musculares esqueléticas lentas e rápidas, independentemente da súa composición precisa de MYH. Isto é consistente coas análises que empregan enfoques transcriptómicos dun só núcleo, que normalmente identifican só dous clústeres mionucleares distintos. 68, 69, 70 Ademais, aínda que estudos proteómicos previos identificaron fibras de tipo 2X, estas fibras non se agrupan separadamente do resto das fibras rápidas e mostran só un pequeno número de proteínas diferencialmente abundantes en comparación con outros tipos de fibras baseadas no MYH. 14 Estes resultados suxiren que deberiamos volver á visión de principios do século XX da clasificación das fibras musculares, que dividía as fibras musculares esqueléticas humanas non en tres clases distintas baseadas no MYH, senón en dous grupos baseados nas súas propiedades metabólicas e contráctiles. 63
Máis importante aínda, a heteroxeneidade das miofibras debe considerarse ao longo de múltiples dimensións. Estudos "ómicas" previos apuntaron nesta dirección, suxerindo que as fibras musculares esqueléticas non forman grupos discretos, senón que se dispoñen ao longo dun continuo. 11, 13, 14, 64, 71 Aquí, mostramos que, ademais das diferenzas nas propiedades contráctiles e metabólicas do músculo esquelético, as miofibras poden diferenciarse por características relacionadas coas interaccións célula-célula e os mecanismos de tradución. De feito, atopamos heteroxeneidade dos ribosomas nas fibras musculares esqueléticas que contribúe á heteroxeneidade independentemente dos tipos de fibras lentas e rápidas. A causa subxacente desta heteroxeneidade substancial das miofibras, independente do tipo de fibra lenta e rápida, segue sen estar clara, pero pode apuntar a unha organización espacial especializada dentro dos fascículos musculares que responden de forma óptima a forzas e cargas específicas,72 a unha comunicación celular ou específica de órganos especializada con outros tipos de células no microambiente muscular73,74,75 ou a diferenzas na actividade dos ribosomas dentro das miofibras individuais. De feito, demostrouse que a heteroplasmia ribosómica, xa sexa mediante a substitución paráloga de RPL3 e RPL3L ou ao nivel da metilación 2'O do ARNr, está asociada á hipertrofia do músculo esquelético76,77. As aplicacións multiómicas e espaciais combinadas coa caracterización funcional de miofibras individuais avanzarán aínda máis a nosa comprensión da bioloxía muscular a nivel multiómico78.
Ao analizar os proteomas de miofibras individuais de pacientes con miopatías nemalínicas, tamén demostramos a utilidade, a eficacia e a aplicabilidade da proteómica de miofibras individuais para dilucidar a fisiopatoloxía clínica do músculo esquelético. Ademais, ao comparar o noso fluxo de traballo coa análise proteómica global, puidemos demostrar que a proteómica de miofibras individuais produce a mesma profundidade de información que a proteómica tisular global e amplía esta profundidade tendo en conta a heteroxeneidade interfibra e o tipo de miofibra. Ademais das diferenzas esperadas (aínda que variables) na proporción de tipos de fibras observadas nas miopatías nemalínicas ACTA1 e TNNT1 en comparación cos controis sans,19 tamén observamos unha remodelación oxidativa e extracelular independente do cambio de tipo de fibra mediado por MYH. A fibrose xa fora descrita en miopatías nemalínicas TNNT1.19 Non obstante, a nosa análise baséase neste achado ao revelar tamén niveis elevados de proteínas relacionadas co estrés segregadas extracelularmente, como as anexinas, implicadas nos mecanismos de reparación sarcolemal, en miofibras de pacientes con miopatías nemalínicas ACTA1 e TNNT1.57,58,59 En conclusión, o aumento dos niveis de anexina nas miofibras de pacientes con miopatía nemalínica pode representar unha resposta celular para reparar miofibras gravemente atróficas.
Aínda que este estudo representa a maior análise de musculatura completa dunha soa fibra en humanos ata a data, non está exenta de limitacións. Illamos fibras musculares esqueléticas dunha mostra relativamente pequena e homoxénea de participantes e dun só músculo (o vasto lateral). Polo tanto, é imposible descartar a existencia de poboacións específicas de fibras en todos os tipos de músculos e nos extremos da fisioloxía muscular. Por exemplo, non podemos descartar a posibilidade de que xurda un subconxunto de fibras ultrarrápidas (por exemplo, fibras 2X puras) en velocistas e/ou atletas de forza altamente adestrados79 ou durante períodos de inactividade muscular66,80. Ademais, o tamaño limitado da mostra de participantes impediunos investigar as diferenzas sexuais na heteroxeneidade das fibras, xa que se sabe que as proporcións de tipos de fibras difiren entre homes e mulleres. Ademais, non puidemos realizar análises transcriptómicas e proteómicas nas mesmas fibras musculares ou mostras dos mesmos participantes. A medida que nós e outros continuamos a optimizar as análises de células individuais e de miofibras individuais mediante a análise ómica para lograr unha entrada de mostra ultrabaixa (como se demostra aquí na análise de fibras de pacientes con miopatía mitocondrial), a oportunidade de combinar enfoques multiómicos (e funcionais) dentro de fibras musculares individuais faise evidente.
En xeral, os nosos datos identifican e explican os impulsores transcricionais e postranscricionais da heteroxeneidade do músculo esquelético. En concreto, presentamos datos que desafían un dogma de longa data na fisioloxía do músculo esquelético asociado coa definición clásica dos tipos de fibras baseada na teoría da hiperpigmentación multiforme (MYH). Agardamos renovar o debate e, en última instancia, repensar a nosa comprensión da clasificación e heteroxeneidade das fibras do músculo esquelético.
Catorce participantes caucásicos (12 homes e 2 mulleres) aceptaron voluntariamente participar neste estudo. O estudo foi aprobado polo Comité de Ética do Hospital Universitario de Gante (BC-10237), cumpriu coa Declaración de Helsinqui de 2013 e rexistrouse en ClinicalTrials.gov (NCT05131555). As características xerais dos participantes preséntanse na Táboa complementaria 1. Tras obter o consentimento informado verbal e por escrito, os participantes sometéronse a un exame médico antes da inclusión final no estudo. Os participantes eran novos (22-42 anos), sans (sen problemas médicos, sen antecedentes de tabaquismo) e moderadamente activos fisicamente. A absorción máxima de osíxeno determinouse usando un ergómetro escalonado para avaliar a aptitude física, como se describiu anteriormente. 81
Recolléronse mostras de biopsia muscular en repouso e en xexún tres veces, con 14 días de diferenza. Dado que estas mostras se recolleron como parte dun estudo máis amplo, os participantes consumiron placebo (lactosa), un antagonista do receptor H1 (540 mg de fexofenadina) ou un antagonista do receptor H2 (40 mg de famotidina) 40 minutos antes da biopsia. Demostramos previamente que estes antagonistas dos receptores da histamina non afectan á aptitude do músculo esquelético en repouso81, e non se observou ningunha agrupación relacionada co estado nas nosas gráficas de control de calidade (Figuras suplementarias 3 e 6). Mantívose unha dieta estandarizada (41,4 kcal/kg de peso corporal, 5,1 g/kg de carbohidratos de peso corporal, 1,4 g/kg de proteínas de peso corporal e 1,6 g/kg de graxa de peso corporal) durante 48 horas antes de cada día experimental, e consumiuse un almorzo estandarizado (1,5 g/kg de carbohidratos de peso corporal) na mañá do día experimental. Baixo anestesia local (0,5 ml de lidocaína ao 1 % sen epinefrina), obtivéronse biopsias musculares do músculo vasto lateral mediante aspiración percutánea de Bergström.82 As mostras musculares incluíronse inmediatamente en RNAlater e almacenáronse a 4 °C ata a disección manual das fibras (ata 3 días).
Os feixes de miofibras recentemente illadas transferíronse a un medio RNAlater fresco nunha placa de cultivo. As miofibras individuais diseccionáronse manualmente cun estereomicroscopio e unhas pinzas finas. Diseccionáronse vinte e cinco fibras de cada biopsia, prestando especial atención á selección de fibras de diferentes áreas da biopsia. Despois da disección, cada fibra mergullouse suavemente en 3 μl de tampón de lise (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) que contiña encimas proteinase K e DNase para eliminar proteínas e ADN non desexados. A lise celular e a eliminación de proteínas/ADN iniciáronse mediante unha breve axitación vortex, xiro do líquido nunha microcentrífuga e incubación a temperatura ambiente (10 min). O lisado incubouse entón nun termociclador (T100, Bio-Rad) a 37 °C durante 5 min, a 75 °C durante 5 min e, a continuación, almacenouse inmediatamente a -80 °C ata o seu posterior procesamento.
As bibliotecas de ARN poliadenilado compatibles con Illumina preparáronse a partir de 2 µl de lisado de miofibras usando o kit de preparación de bibliotecas de mRNA-Seq de 3′ QuantSeq-Pool (Lexogen). Os métodos detallados pódense atopar no manual do fabricante. O proceso comeza coa síntese de ADNc da primeira cadea por transcrición inversa, durante a cal se introducen identificadores moleculares únicos (UMI) e códigos de barras i1 específicos da mostra para garantir a agrupación de mostras e reducir a variabilidade técnica durante o procesamento posterior. O ADNc de 96 miofibras agrúpase e purifícase entón con esferas magnéticas, despois do cal se elimina o ARN e se realiza a síntese da segunda cadea usando cebadores aleatorios. A biblioteca purifícase con esferas magnéticas, engádense etiquetas i5/i7 específicas do grupo e amplifícase por PCR. Un paso final de purificación produce bibliotecas compatibles con Illumina. A calidade de cada grupo de bibliotecas avaliouse usando o kit de análise de ADN de pequenos fragmentos de alta sensibilidade (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Baseándose na cuantificación de Qubits, as agrupacións agrupáronse aínda máis en concentracións equimolares (2 nM). A continuación, a agrupación resultante secuenciouse nun instrumento NovaSeq 6000 en modo estándar usando o kit de reactivos NovaSeq S2 (1 × 100 nucleótidos) cunha carga de 2 nM (4 % de PhiX).
A nosa canle de traballo baséase na canle de análise de datos QuantSeq Pool de Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Os datos foron primeiro desmultiplexados con bcl2fastq2 (v2.20.0) baseándose no índice i7/i5. A lectura 2 foi despois desmultiplexada con idemux (v0.1.6) baseándose no código de barras da mostra i1 e as secuencias UMI foron extraídas con umi_tools (v1.0.1). As lecturas foron entón recortadas con cutadapt (v3.4) en varias roldas para eliminar lecturas curtas (<20 de lonxitude) ou lecturas que consistían unicamente en secuencias adaptadoras. As lecturas foron entón aliñadas co xenoma humano usando STAR (v2.6.0c) e os ficheiros BAM foron indexados con SAMtools (v1.11). As lecturas duplicadas foron eliminadas usando umi_tools (v1.0.1). Finalmente, a conta de aliñamentos realizouse usando featureCounts en Subread (v2.0.3). O control de calidade realizouse mediante FastQC (v0.11.9) en varias etapas intermedias da cadea de produtos.
Todo o procesamento e visualización bioinformática posterior realizouse en R (v4.2.3), principalmente empregando o fluxo de traballo Seurat (v4.4.0).83 Polo tanto, os valores UMI individuais e as matrices de metadatos transformáronse en obxectos Seurat. Elimináronse os xenes expresados ​​en menos do 30 % de todas as fibras. Elimináronse as mostras de baixa calidade en función dun limiar mínimo de 1000 valores UMI e 1000 xenes detectados. Finalmente, 925 fibras superaron todos os pasos de filtrado do control de calidade. Os valores UMI normalizáronse empregando o método Seurat SCTransform v2,84 incluíndo as 7418 características detectadas, e as diferenzas entre os participantes foron eliminadas por regresión. Todos os metadatos relevantes pódense atopar no conxunto de datos complementario 28.